一、概述-- Xenium組織空間原位多組學(xué)分析系統(tǒng)

這是一臺高度自動化、高通量的組織原位分析技術(shù)平臺，幫助用戶實現(xiàn)亞細胞分辨率的靶向基因和蛋白表達原位分析。它在10x Genomics早期收購的ReadCoor和Cartana的基礎(chǔ)技術(shù)之上做了大量研發(fā)和改進。Xenium將單分子RNA和蛋白檢測的功能與強大的光學(xué)元件、數(shù)據(jù)采集和解碼技術(shù)相結(jié)合，能夠以亞細胞分辨率在整張切片上快速檢測大量靶點的組織原位表達水平。該平臺可以兼容多種樣品類型，包括新鮮冷凍（FF）組織和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織。Xenium平臺擁有一條不斷拓展的產(chǎn)品路線圖，不斷增強核心平臺的分析能力和分析物種類，比如一張切片同時檢測RNA和蛋白質(zhì)表達水平。品牌10x Genomics，型號Xenium In Situ，產(chǎn)地新加坡，代理商是斑馬魚（北京）科技有限公司，從組織制備到數(shù)據(jù)分析，該平臺將會得到技術(shù)專家團隊的支持。

二、平臺概覽 The Xenium In Situ platform

有了Chromium和Visium等分析，研究人員能夠分別檢測單個細胞或整張組織切片的全轉(zhuǎn)錄組。在后續(xù)研究中，他們可以采用靶向原位分析技術(shù)，這不僅能夠在組織細胞生物學(xué)狀態(tài)下對細胞進行定位和分型，還能夠針對先前從Chromium和Visium數(shù)據(jù)中獲得的信息來詳細研究各種具體問題。

Xenium平臺可幫助科學(xué)家展示、定量和分析固定在載玻片上的FF和FFPE組織切片中的基因表達和蛋白豐度。還將提供一系列針對不同組織類型和應(yīng)用場景的試劑菜單選項，以及添加客戶定制靶點的選項，從而實現(xiàn)對目標靶點進行高靈敏度的原位分析。

這是一個端對端的完整解決方案，包含一臺強大的可實現(xiàn)高通量分析的全自動儀器，提供機載分析功能，可處理圖像數(shù)據(jù)，定位RNA和蛋白信號，并開展二級分析。您也可以輕松地傳輸數(shù)據(jù)，使用10x Genomics提供的軟件或您選擇的第三方軟件工具進行分析可視化。

三、工作流程概覽

Xenium工作流程從在Xenium載玻片上制備組織切片開始（圖1）。對切片進行處理以暴露出易于雜交的RNA和蛋白質(zhì)分子，并分別用可環(huán)化的DNA探針和帶有DNA標簽序列的抗體進行雜交標記。DNA探針的兩側(cè)帶有兩個目標RNA特異性的獨立雜交的區(qū)域。它們還包含基因特異性的標簽序列。每對探針末端在與目標RNA區(qū)域雜交后會連接產(chǎn)生可酶促擴增的環(huán)狀DNA探針。這種連接設(shè)計確保了每對探針與目標RNA區(qū)域雜交的高特異性。蛋白質(zhì)檢測將是該平臺未來將拓展的一項功能，它將采用熒光探針雜交標記蛋白的DNA條碼序列來檢測組織切片中每種標記蛋白的表達水平。

每次實驗中，可將最多兩張載玻片放入Xenium分析儀內(nèi)。結(jié)合在RNA上的擴增后的DNA環(huán)狀探針與熒光標記的已知短序列探針結(jié)合，產(chǎn)生明亮、易于成像且信噪比高的信號。樣本經(jīng)過連續(xù)幾輪的熒光探針雜交、成像和去除。接著生成每個基因特異性的熒光特征條碼，從而實現(xiàn)目標基因的定位和識別。通過熒光探針與抗體上DNA標簽序列的雜交可進一步檢測蛋白質(zhì)，并構(gòu)建出整張組織切片上轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的全景空間表達圖譜。然后，通過細胞核染色，確定細胞核膜位置、形態(tài)來推斷細胞邊界，或通過細胞形態(tài)染色來確定細胞邊界。最后將細胞邊界信息映射到RNA和蛋白表達圖像上，并將轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)根據(jù)位置坐標分配給每個細胞。

四、Xenium平臺

1.樣本制備

Xenium工作流程與FF組織和FFPE組織都兼容，首先是在Xenium載玻片制備所需組織的切片。這些切片經(jīng)過脫蠟和透化等處理，讓RNA和蛋白分析物暴露出來。RNA與可環(huán)化的DNA探針雜交結(jié)合，該探針包含兩個與目標RNA特異性雜交的區(qū)域以及另一個基因特異性標簽序列區(qū)域。探針的兩端與目標RNA雜交結(jié)合，通過連接兩端后產(chǎn)生環(huán)狀DNA探針。如果探針發(fā)生非特異雜交或脫靶，則不會發(fā)生連接反應(yīng)，從而抑制非特異性信號并確保高特異性。未來的蛋白檢測功能將采用熒光探針雜交標記抗體的DNA標簽序列來檢測組織切片中每種被標記蛋白的表達水平。DNA探針連接后，環(huán)化探針經(jīng)過酶促擴增，生成每個RNA雜交事件的基因特異性標簽序列的多個拷貝。這會產(chǎn)生更強的信號，易于成像分析且信噪比高，這在分析自發(fā)熒光背景高的樣本（如FFPE組織）時尤其重要。

2. Xenium分析儀上的解碼流程

Xenium分析儀（圖2）是全自動的，帶有數(shù)據(jù)并行處理功能，可快速輸出數(shù)據(jù)，幫助用戶及時進行數(shù)據(jù)分析解讀。儀器內(nèi)置成像系統(tǒng)使用高數(shù)值孔徑(NA)以及帶有低噪聲傳感器的快速區(qū)域掃描照相機，可實現(xiàn)約200 nm的像素分辨率。它的視場為600 x 900 μm，Z軸多層光切圖像是在整個組織厚度上以0.75 μm的步長逐一獲得的。FFPE組織切片的常見厚度通常為5μm，而FF組織切片厚度為10 μm。采集的圖像可通過Xenium分析軟件進行處理，以實現(xiàn)sub-50 nm定位分辨率的單分子水平檢測。此外，該儀器還集成了樣本處理、液路和寬場熒光顯微鏡成像系統(tǒng)。Xenium分析儀一次運行最多可上樣兩塊載玻片，每塊玻片的可成像分析區(qū)域面積約為12 x 24 mm。這樣大小的成像分析面積讓科學(xué)家能夠靈活地在每塊載玻片上放置多張切片和多個樣本。分析物檢測和圖像采集分析是在Xenium分析儀上按逐個循環(huán)進行的。試劑耗材（包括檢測RNA和蛋白質(zhì)分子的熒光標記探針）在儀器內(nèi)全自動運行每個循環(huán)、孵育、成像和移除。

在熒光標記的探針與擴增后的基因特異性標簽序列結(jié)合后，樣本會經(jīng)歷連續(xù)幾輪的熒光探針雜交、成像和探針移除。對于分析物檢測，在此過程的每個循環(huán)中，每個標簽序列，也就是每個RNA的標記，都以特定的顏色打開或關(guān)閉。這會產(chǎn)生每個基因特異性的熒光特征條碼。在讀取這個打開或關(guān)閉的熒光特征條碼后，軟件可解碼出所有目標基因的身份。在儀器結(jié)束運行時，系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行分析整合，并構(gòu)建整張組織切片上轉(zhuǎn)錄本的空間圖譜。成像系統(tǒng)使用高數(shù)值孔徑以及帶有低噪聲傳感器的快速區(qū)域掃描照相機，實現(xiàn)高靈敏度和高分辨率的原位分析。

3. 基因和蛋白靶向試劑

Xenium平臺使用靶向試劑組合在亞細胞分辨率水平檢測組織原位基因和蛋白表達量。使用組織和應(yīng)用特異性基因組合，并支持額外客戶定制基因選項，將是解決不同類型樣本中基因和蛋白表達多樣性和差異性的最好策略。商業(yè)基因組合試劑是經(jīng)過大量數(shù)據(jù)挖掘甄選后構(gòu)建的，綜合了全面的單細胞圖譜研究結(jié)果以及各個研究領(lǐng)域?qū)＜业娜斯徍撕蛯氋F建議。

基因組合

10x Genomics正在針對某些組織和應(yīng)用開發(fā)商業(yè)試劑的基因組合菜單。這些模塊化的組合可分開或組合使用，可以更好的支持各個項目的個性化需求。每個Xenium基因組合預(yù)計包含幾百個基因，并且可針對每個項目進行定制，目前計劃最多可添加50個客戶定制基因。商業(yè)試劑組合定制基因組合的最初的最大多重檢測能力為400個基因。Xenium平臺本身是為1,000個基因的多重檢測能力而開發(fā)的。未來的產(chǎn)品擴展將讓Xenium基因組合適用于更多物種、組織和研究應(yīng)用方向。最終也將有望根據(jù)研究人員的需求提供更多客戶定制功能。

蛋白質(zhì)組合

未來的產(chǎn)品線擴展將增加蛋白質(zhì)組合，作為Xenium產(chǎn)品線的一部分。

4. 軟件系統(tǒng)——數(shù)據(jù)管理和分析

Xenium平臺包含機載分析功能，能夠處理圖像數(shù)據(jù)，定位分析物信號，并開展二級分析，以便將分析的靶點表達信息分配給不同細胞，生成分析物表達譜——細胞矩陣。二級分析使用細胞核和細胞形態(tài)信息來鑒定組織切片上的細胞邊界。機載分析與儀器運行并行開展，實現(xiàn)最短運轉(zhuǎn)周期。Xenium整體解決方案還將包含基因組合探針設(shè)計工具，以便完成上游實驗設(shè)計和個性化實驗定制功能。

Xenium解決方案還包含了用于下游分析的數(shù)據(jù)分析管線和可視化工具，讓科學(xué)家能夠探索和挖掘Xenium數(shù)據(jù)。這將幫助科學(xué)家能夠快速獲取可分析、解釋的組織原位分析數(shù)據(jù)。Xenium分析儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可輕松從儀器中下載、轉(zhuǎn)移出來，并與對應(yīng)的組織形態(tài)和細胞邊界等信息結(jié)合分析，通過10x Genomics提供的軟件進行可視化和進一步分析。此外，數(shù)據(jù)還可以開放的標準文件格式輸出，便于研究人員使用第三方軟件和專業(yè)研究者開發(fā)的高階工具進行數(shù)據(jù)分析。

5. 技術(shù)培訓(xùn)和支持

10x產(chǎn)品包括Xenium、Visium CytAssist、Chromium Controller，Chromium X、Chromium™ Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit、Visium Spatial for FFPE Gene Expression Kit、Chip G、Feature Barcode Library Kit……斑馬魚（北京）科技有限公司是10x Genomics代理商，負責(zé)銷售儀器和試劑，具備豐富的單細胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組實驗方面經(jīng)驗，可為用戶提供單細胞懸液制備，建庫，測序，生信分析等一整套解決方案。在購買Xenium分析儀后，將安排有資質(zhì)的工程師進行現(xiàn)場安裝和培訓(xùn)。培訓(xùn)內(nèi)容包括樣本制備、儀器操作、數(shù)據(jù)分析。在培訓(xùn)完成后，客戶還將獲得支持，包括遠程技術(shù)支持（Technical Support）、現(xiàn)場應(yīng)用科學(xué)家（FAS）、現(xiàn)場服務(wù)工程師（FSE）和生物信息學(xué)應(yīng)用（Applied Bioinformatics）團隊，覆蓋實驗工作流程、試劑耗材、儀器和軟件的各個方面。

6. 基礎(chǔ)技術(shù)

Xenium技術(shù)建立在收購ReadCoor和Cartana公司而獲得的技術(shù)基礎(chǔ)之上，這兩家公司分別由George Church和Mats Nilsson實驗室開發(fā)并商業(yè)化而來，Xenium技術(shù)同時融合了10x Genomics自主開發(fā)的技術(shù)。綜合以上各種基礎(chǔ)技術(shù)產(chǎn)生的10x Genomics專有的原位分析技術(shù)在靈敏度、特異性和樣品通量方面都比原來基礎(chǔ)技術(shù)提高了數(shù)倍。

五、代表性的數(shù)據(jù)

以下這些數(shù)據(jù)集，是使用Xenium分析儀和200基因的人類乳腺癌基因組合從FFPE包埋的人類浸潤性乳腺癌組織切片上生成的，并與同一組織塊的蘇木精和伊紅（H&E）染色切片進行比較，H&E染色切片之前由病理學(xué)家進行了切片注釋，并通過Visium FFPE技術(shù)進行了檢測和分析。

1. Xenium數(shù)據(jù)

使用包含200個基因組合試劑對人類浸潤性乳腺癌FFPE組織進行分析。分析后生成了一幅轉(zhuǎn)錄本的空間圖譜，每個RNA轉(zhuǎn)錄本帶有x、y和z坐標。通過DAPI染色確定細胞核邊界，并通過擴展細胞核邊緣來估算細胞邊界（圖3）。所有RNA轉(zhuǎn)錄本被分配到特定細胞中，并生成gene-by-cell矩陣。根據(jù)每個細胞的RNA含量和基因組合中的標志物識別細胞類型。例如，ERBB2可用來鑒定腫瘤細胞，而編碼核心蛋白聚糖的DCN可用來鑒定基質(zhì)細胞。淋巴細胞和巨噬細胞可通過特定CD標志物來鑒定。按照分配的細胞類型對不同細胞進行不同色彩標識。這就產(chǎn)生了按細胞類型來區(qū)分的細胞空間表達圖譜，每個細胞內(nèi)有分配到該細胞的全部靶向RNA轉(zhuǎn)錄本。

2. 關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)比較

來自同一乳腺癌FFPE組織塊切片的H&E染色結(jié)果顯示的腫瘤特征。病理學(xué)家對該FFPE切片的注釋，確定了浸潤腫瘤被各種纖維組織、脂肪組織和腫瘤壞死區(qū)域環(huán)繞。Xenium數(shù)據(jù)與病理學(xué)家注釋的浸潤癌的特征具有很好的相關(guān)性（圖4）。

接著使用Visium FFPE空間基因表達分析對同一組織切片進行處理，以便將通過Visium數(shù)據(jù)觀察到的空間表達圖譜分布與通過Xenium獲得的原位表達圖譜進行比較。我們發(fā)現(xiàn)，使用Visium數(shù)據(jù)（通過NGS測序得到的數(shù)據(jù)）和Xenium數(shù)據(jù)（通過顯微鏡以亞細胞分辨率檢測得到的數(shù)據(jù)）觀察到的基因空間分布之間存在很強的相關(guān)性（圖4）。

綜上，這些數(shù)據(jù)表明，Xenium平臺可以很好地重現(xiàn)病理學(xué)家注釋的H&E染色圖像的細胞分型和病理區(qū)域注釋，并可以高分辨率驗證使用Visium平臺觀察到的基因表達空間分布。

六、主要應(yīng)用場景

使用Xenium組織空間原位多組學(xué)分析系統(tǒng)，研究人員能夠通過亞細胞分辨率的多重RNA和蛋白質(zhì)表達檢測加深對健康和病變組織的了解。主要應(yīng)用在以下方面：

• 繪制阿爾茨海默病的細胞類型圖譜(1)

• 根據(jù)多種細胞類型的多個標志物基因?qū)M織切片進行空間原位解析(2,3)

• 對復(fù)雜發(fā)育過程及背后的細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)進行時空組學(xué)原位解析(4)

• 對單細胞測序數(shù)據(jù)進行組織切片原位驗證，原位分析結(jié)果可以加深對組織亞結(jié)構(gòu)分子基礎(chǔ)的進一步了解(5)

以上文獻中的數(shù)據(jù)僅代表原位技術(shù)的一般應(yīng)用，不代表10x Genomics Xenium平臺的靈敏度和分辨率。自從收購了Cartana和ReadCoor兩家原位測序技術(shù)公司以來，10x Genomics投入大量人力物力對上述范例中描述的原位技術(shù)進行持續(xù)的開發(fā)和改進。Xenium分析儀將以上兩種基礎(chǔ)原位測序技術(shù)與10x Genomics專有改進方案相結(jié)合，提供了一個分辨率和靈敏度比上述已發(fā)表數(shù)據(jù)更高的全新平臺。Xenium還顯著改進了原位分析技術(shù)的易用性和數(shù)據(jù)生成時間。

七、使用Xenium平臺開展原位分析研究的理由

Xenium組織空間原位多組學(xué)分析系統(tǒng)具有許多技術(shù)優(yōu)勢，已成為以亞細胞分辨率分析多重空間基因表達和蛋白質(zhì)表達的理想產(chǎn)品。該平臺的核心是全自動和高通量的Xenium分析儀，可以自動進行探針標記、成像和機載數(shù)據(jù)分析等全流程功能。

• 強大而靈活的核心平臺——Xenium是一個強大而靈活的核心平臺，適用于各種組織、樣本類型和應(yīng)用。此外，該平臺的設(shè)計理念是未來可不斷增添新功能，包括額外的組織特異性和疾病特異性的基因組合、同一切片上RNA和蛋白質(zhì)的同時檢測，以及同時檢測1,000種分析物的多重分析能力。

• 起始樣本的靈活性——Xenium技術(shù)流程可以兼容新鮮冷凍組織（FF）和福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）樣品。

• 多重分析和亞細胞分辨率——Xenium平臺能夠以亞細胞分辨率檢測多達400個RNA轉(zhuǎn)錄本（初上市時），并有望在未來實現(xiàn)多達1,000個分析物的同時檢測。

• 具有定制功能的人工審核基因組合——Xenium平臺可使用商業(yè)試劑的基因組合，這些基因組合是經(jīng)過大量數(shù)據(jù)挖掘甄選后構(gòu)建的，綜合了全面的單細胞圖譜研究結(jié)果以及各個研究領(lǐng)域?qū)＜业娜斯徍撕蛯氋F建議。Xenium基因組合能夠增加定制基因集合，這些基因組合在交付后可立即用于Xenium分析。此外，10x Genomics還致力于不斷擴展商業(yè)試劑供應(yīng)的Xenium基因組合菜單種類，逐步會包含更多的組織和應(yīng)用類型。

• 輕松易用的流程——Xenium平臺是一個輕松易用的完整解決方案，包含制備樣本所需的試劑和Xenium分析儀上配合圖像采集需要的試劑，以及用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析、可視化和數(shù)據(jù)解讀的10x Genomics軟件。

• 超大通量——Xenium分析儀可在成像區(qū)域內(nèi)開展超高重靶點組織全景分析。每塊Xenium載玻片上有一個大的可成像區(qū)域（12 x 24 mm），單次運行可同時加載和分析兩張切片。單次樣品通量由可成像區(qū)域內(nèi)包含的組織切片數(shù)量決定。例如，如果組織切片的大小為10 mm x 10 mm，則每塊載玻片可容納兩張切片，并且單次運行可同時分析四張切片。儀器運行大約需要兩天的時間，每周通量為12張組織切片/周，以此類推，分析樣品組織切片越小，單周內(nèi)可分析的樣品數(shù)目會顯著增加。

• 全面的數(shù)據(jù)分析解決方案——10x Genomics提供數(shù)據(jù)分析流程用于數(shù)據(jù)分析和再分析，并提供*進的軟件用于數(shù)據(jù)可視化分析。Xenium分析儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可輕松從儀器中轉(zhuǎn)移出來，并與基本組織形態(tài)、細胞邊界信息等結(jié)合用于可視化分析。10x Genomics提供的軟件支持進一步高階分析。數(shù)據(jù)以行業(yè)標準的文件格式提供，讓科學(xué)家可自由使用他們選擇的各類分析工具。

• 細胞類型分配——10x Genomics軟件將每個檢測到的轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)分配給單個細胞，讓科學(xué)家能夠根據(jù)他們選擇的基因組合對細胞類型進行分子水平注釋。

• 全面專業(yè)的支持資源——10x Genomics提供全面的支持資源，既包括我們的技術(shù)支持科學(xué)家、現(xiàn)場應(yīng)用科學(xué)家、現(xiàn)場服務(wù)工程師和生物信息學(xué)應(yīng)用科學(xué)家，他們都接受過Xenium流程、儀器和分析的專業(yè)培訓(xùn)，也包括免費提供的視頻和技術(shù)文檔，這些可幫助指導(dǎo)新用戶順利完成Xenium實驗流程。

• 產(chǎn)品質(zhì)量認證——10x Genomics的產(chǎn)品開發(fā)和制造流程已通過ISO 9001:2015認證。

八、斑馬魚（北京）科技有限公司，是10x Genomics公司的授權(quán)經(jīng)銷商，負責(zé)產(chǎn)品的推廣銷售和技術(shù)支持，為您提供技術(shù)參數(shù)，報價、選型、實驗指導(dǎo)、安裝培訓(xùn)、售后服務(wù)等，更多信息可和我們聯(lián)系。