Thermo Scientific™ CloneJET™ PCR Cloning Kit是一個(gè)的陽性選擇克隆系統(tǒng)，可以高效克隆各種PCR產(chǎn)物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。陽性選擇載體和插入片段連接僅需5分鐘即可獲得超過99%的陽性重組克隆。PCR產(chǎn)物無需純化。由具有校正活性的聚合酶(如：Pfu polymerase)擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體。由無校正活性的聚合酶(如：Taq polymerase)或聚合酶混合物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在連接前需用試劑盒提供的熱穩(wěn)定DNA平端化酶削平突出末端(5分鐘即可)。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株。

試劑盒提供一個(gè)新穎的即用型陽性選擇克隆載體pJET2.1/blunt。該載體含有致死的限制酶基因(內(nèi)含多克隆位點(diǎn))。多克隆位點(diǎn)插入外源片段會(huì)引起酶基因失活。因此只有轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的細(xì)菌才能存活形成克隆菌落。而自身環(huán)化的pJET1.2/blunt載體表達(dá)致死的限制酶(無外源片段插入)，轉(zhuǎn)化后殺死大腸桿菌細(xì)胞。這種陽性篩選策略極大地加速了克隆篩選進(jìn)程，節(jié)省了藍(lán)白斑篩選的額外費(fèi)用。

為方便酶切作圖和插入片段基因操作，pJET1.2/blunt克隆載體的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)各包含一個(gè)BglII識別序列。此外，該載體含有T7啟動(dòng)子，可用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄、插入片段測序等研究。

特點(diǎn)

• 快速 一 PCR克隆只需5分鐘。
• 高效 一 >99%陽性克隆。
• 無克隆背景 一 陽性篩選載體。
• 通用一適合平末端和粘性末端克隆。
• 經(jīng)濟(jì) 一 無需昂貴的藍(lán)白篩選。

應(yīng)用

• 適用平末端和帶有3'-dA尾的PCR產(chǎn)物克隆。
• 限制酶切割產(chǎn)物克隆。
• 測序克隆的DNA。
• 克隆插入片段體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)錄(T7啟動(dòng)子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄)。

質(zhì)量控制

功能測試：含有3’-dA尾的對照PCR產(chǎn)物克隆證明重組子比率>99%。載體自連實(shí)驗(yàn)表明無克隆背景。pJET1.2 primers適合特異性高效測序。

組分

• pJET1.2/blunt Cloning Vector (pJET1.2 DNA sequence in txt format)
• T4 DNA Ligase
• 2X Reaction Buffer
• Blunting Enzyme
• pJET1.2 Forward Sequencing Primer
• pJET1.2 Reverse Sequencing Primer
• Control PCR Product (sequence of control PCR product in txt format)
• Water, nuclease-free
• 詳細(xì)的操作手冊

備注

電轉(zhuǎn)化前，需用氯仿抽提使連接產(chǎn)物中的T4 DNA連接酶失活。