抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是通過(guò)連接子將小分子化合物偶聯(lián)至靶向性抗體或抗體片段上的一類新型的生物技術(shù)藥物，可以增強(qiáng)藥物的靶向性和穩(wěn)定性，同時(shí)減少臨床毒副反應(yīng)、提高治療指數(shù)，且兼具傳統(tǒng)小分子藥物的殺傷效應(yīng)和抗體藥物的靶向性，當(dāng)下主要是應(yīng)用于抗腫瘤或者其他疾病的靶向治療的熱門藥物，是新型的“生物導(dǎo)-彈"。

因此，ADC藥物一般由單克隆抗體（mAb）、載荷小分子（payload）和連接子（Linker）三部分組成，通過(guò)抗體靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原，將細(xì)胞毒素精準(zhǔn)高效地遞送到腫瘤部位，同時(shí)避開正常組織，發(fā)揮高其特異性靶向能力和強(qiáng)效的殺傷作用。這復(fù)雜的“精準(zhǔn)導(dǎo)-彈"目標(biāo)，對(duì)ADC藥物提出了高穩(wěn)定性、高利用率的要求，即ADC藥物既要在血液循環(huán)中維持穩(wěn)定，又要在到達(dá)腫瘤部位精準(zhǔn)釋放，所以體外研究ADC藥物血液穩(wěn)定性、小分子毒素payload釋放及代謝具有重要意義。本篇文章將整體闡述ADC藥物體外研究思路并提供“一站式"解決方案。

根據(jù)中國(guó)國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心（NMPA）發(fā)布的關(guān)于《抗體偶聯(lián)藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指示，對(duì)ADC藥物的研究應(yīng)從藥理學(xué)、安全藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及毒理學(xué)等四個(gè)方面展開。

一、ADC藥物在體外血液基質(zhì)中穩(wěn)定性研究的策略

藥代動(dòng)力學(xué)藥物體外研究的重中之重。作為抗腫瘤藥物，ADC藥物應(yīng)在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，避免載荷釋放過(guò)早導(dǎo)致毒素積累和發(fā)生不良反應(yīng)。NMPA發(fā)布的指導(dǎo)原則其明確指出：“臨床試驗(yàn)開展前，需在人和動(dòng)物（藥理試驗(yàn)和/或毒理試驗(yàn)動(dòng)物）的血漿和/或全血等介質(zhì)中考察ADC的體外穩(wěn)定性。"因此，采用血液基質(zhì)在體外評(píng)估ADC藥物的穩(wěn)定性是合理且方便的方法。

血漿（Plasma）是血液的重要組成部分，為淡黃色液體，由蛋白質(zhì)、脂類、無(wú)機(jī)鹽、糖、氨基酸、代謝廢物以及大量的水組成，由血液和抗凝劑混合后進(jìn)一步離心所得，其內(nèi)不含或含極少血細(xì)胞，是ADC體外穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的最常規(guī)基質(zhì)。常規(guī)小分子藥物的抗凝劑有EDTA、肝素鈉或肝素鋰，而ADC藥物由于其本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，常規(guī)EDTA抗凝劑為蛋白酶和核酸酶的抑制劑，所以EDTA抗凝劑類血漿不適用于體外ADC藥物穩(wěn)定性考察。

血清（Serum）則是利用促凝管將血液完-全凝固離心后的黃色透明液體，其內(nèi)不含纖維蛋白原，也避免了可能由抗凝劑引起的蛋白結(jié)合、酶活抑制和樣品穩(wěn)定性等方面的風(fēng)險(xiǎn)，已逐漸成為ADC藥物體外穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的另一介質(zhì)。無(wú)論是血漿還是血清，為模擬體內(nèi)穩(wěn)定性，均應(yīng)將ADC藥物添加在血漿/血清中，于37℃下進(jìn)行孵育，孵育時(shí)常最長(zhǎng)不超過(guò)21天。由于孵育時(shí)間較長(zhǎng)，所以應(yīng)避免在這期間內(nèi)血液基質(zhì)出現(xiàn)污染的情況。因此，有部分客戶也會(huì)選擇使用無(wú)菌血漿/血清進(jìn)行驗(yàn)證。最后可檢測(cè)ADC的變化和/或游離payload的生成。目前捕獲ADC藥物的一種方法是將ADC中抗體對(duì)應(yīng)的二抗加入到孵育后的溶液中，再結(jié)合SA磁珠，即可將ADC藥物從孵育液中吸附出來(lái)，而后使用LC-MS/MS或其它儀器進(jìn)行藥物分析。

全血(Blood)基質(zhì)最-接近體內(nèi)真實(shí)環(huán)境，包含血細(xì)胞和血漿所有成分，也是NMPA推薦的體外穩(wěn)定性驗(yàn)證體系之一。但全血因含血細(xì)胞成分，僅能使用新鮮基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，不適合低溫凍存，也不方便運(yùn)輸，且全血在孵育24小時(shí)以上伴隨著血細(xì)胞不斷破裂的風(fēng)險(xiǎn)，所以對(duì)于需長(zhǎng)時(shí)間孵育的ADC藥物來(lái)說(shuō)，適用性有限。也因此，目前對(duì)于ADC藥物使用全血進(jìn)行體外穩(wěn)定性驗(yàn)證的數(shù)據(jù)較少。

二、ADC藥物的藥理/毒理學(xué)研究

【ADC藥物的藥理/藥效學(xué)研究】

體外藥理/藥效學(xué)研究對(duì)ADC的抗體部分要求更高。ADC藥物的重要組成是抗體，由Fab端和Fc端組成，F(xiàn)ab端主要發(fā)揮抗原結(jié)合功能，而Fc端決定抗體的效應(yīng)功能，包含抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis，ADCP）及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用（Complement Dependent Cytotoxicity，CDC）效應(yīng)。

ADCC，是指抗體通過(guò)Fab段與靶細(xì)胞（病毒感染的細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞）表面抗原決定簇特異性結(jié)合后，其Fc段可與有FcγR的殺傷細(xì)胞【NK細(xì)胞（Natural Killer Cell，NK）、單核細(xì)胞（Monocytes）、巨噬細(xì)胞（Macrophages，m?）、中性粒細(xì)胞（Neutrophil）】等效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，觸發(fā)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性，直接殺傷靶細(xì)胞（病毒感染的細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞），這個(gè)過(guò)程稱為ADCC。

與ADCC不同，ADCP也是用于識(shí)別和介導(dǎo)治療性抗體作用于腫瘤細(xì)胞的一種重要機(jī)制。于ADCP而言，F(xiàn)cγRIIa是該過(guò)程的主要FcγR受體，該過(guò)程由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞（Dendritic cells, DC）通過(guò)表達(dá)FcγRIIa（CD32a）、FcγRI（CD64）和FcγRIIIa（CD16a）來(lái)介導(dǎo)來(lái)吞噬疾病細(xì)胞。

除了上述兩種抗體依賴性效應(yīng)，也需考慮補(bǔ)體系統(tǒng)帶來(lái)的細(xì)胞毒性作用，即CDC效應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)是重要的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，由多種血清蛋白組成的級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，其家族成員超過(guò)40種蛋白質(zhì)。其中補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性，指的是補(bǔ)體參與的細(xì)胞毒作用，即通過(guò)特異性抗體與細(xì)胞膜表面相應(yīng)抗原結(jié)合，形成復(fù)合物而激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，所形成的攻膜復(fù)合物（MAC）對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮裂解效應(yīng)。

因此，針對(duì)ADC藥物的研究還需考慮抗體本身帶來(lái)的效應(yīng)功能，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，采用自研產(chǎn)品，針對(duì)不同效應(yīng)功能，采用合適的藥物進(jìn)行驗(yàn)證篩選，以便為不同客戶提供最佳方案！以ADCC效應(yīng)為例，發(fā)揮效應(yīng)功能主要依賴于PBMC中的NK細(xì)胞或NK細(xì)胞本身，而PBMC是較為常規(guī)的試驗(yàn)系統(tǒng)選擇，因此，合適的PBMC于抗體客戶而言至關(guān)重要。鑒于此，IPHASE技術(shù)人員將PBMC、腫瘤細(xì)胞（Raji）與抗體藥物利妥昔單抗（RTX）共孵育，同時(shí)不含RTX組為對(duì)照組。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組（含RTX）較對(duì)照組而言，抗體藥物濃度越高，殺死的腫瘤細(xì)胞越多，并最終趨于一個(gè)最大值。說(shuō)明此批次PBMC ADCC效應(yīng)的殺傷率可達(dá)30%以上，是客戶進(jìn)行抗腫瘤或抗感染研究的不-二選擇！

而針對(duì)于ADCP和CDC效應(yīng)，IPHASE也擁有如單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及提供補(bǔ)體的人和SPF級(jí)猴血清等產(chǎn)品，為客戶的藥理學(xué)研究提供多種選擇！

【ADC藥物抗體部分的毒理學(xué)研究】

于復(fù)雜的ADC藥物而言，抗體部分的毒理學(xué)研究也尤為重要。單克隆抗體( (Monoclonal antibody, mAb)類藥物通常具有特定的免疫特性，除與適應(yīng)癥相關(guān)特定靶部位抗原結(jié)合外，若人體正常組織中存在相同或相似的抗原決定簇，還會(huì)與靶器官外的組織或細(xì)胞結(jié)合從而產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，組織交叉反應(yīng)(Tissue Cross-Reactivity，TCR)試驗(yàn)應(yīng)運(yùn)而生，即在體外檢測(cè)單抗或相關(guān)抗體樣生物制品與組織上的抗原決定部位結(jié)合的試驗(yàn)，常用檢測(cè)方法為免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunocytochemistry, IHC），該試驗(yàn)是抗體類藥物I期臨床前安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分。為確保抗體類藥物的安全性，合理設(shè)計(jì)的TCR研究設(shè)計(jì)，規(guī)范的試驗(yàn)操作，能夠有效控制試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而判定抗體類藥物是否存在組織交叉反應(yīng)。TCR試驗(yàn)的結(jié)果可幫助確認(rèn)受試抗體與藥效靶組織抗原決定部位的結(jié)合，檢測(cè)抗體是否與非靶部位組織抗原(如組織交叉反應(yīng)抗原)結(jié)合，確定非臨床安全性試驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物種屬，以及預(yù)測(cè)毒性靶器官。

依據(jù)美國(guó)FDA的PTC指南和NMPA人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則中的要求，組織交叉反應(yīng)（Tissue Cross-Reactivity，TCR）研究所需的組織材料應(yīng)為手術(shù)或者活檢的新鮮組織，用恰當(dāng)?shù)娜〔?、固定及保存方法制備成冰凍切片或石蠟切片。并且，正常人體冰凍組織至少要選擇3套來(lái)自不同個(gè)體的捐獻(xiàn)者，而非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物及嚙齒類動(dòng)物冰凍組織則至少選擇2套來(lái)自不同的動(dòng)物個(gè)體。鑒于此，IPHASE以市場(chǎng)為導(dǎo)向，憑借在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域幾十年深耕的經(jīng)驗(yàn)和完善的產(chǎn)品研發(fā)生產(chǎn)平臺(tái)，現(xiàn)可提供高品質(zhì)的石蠟包埋組織、OCT包埋組織、冰凍組織及對(duì)應(yīng)處理方式的組織切片等多個(gè)品類的正常人體組織、猴組織和其它動(dòng)物組織的產(chǎn)品，并可提供相應(yīng)的免疫組化染色產(chǎn)品，為客戶的TCR試驗(yàn)提供原材料。以下為FDA要求的32種組織。

注：以上組織除血細(xì)胞外本司均可同時(shí)提供切片及芯片，血細(xì)胞僅可提供切片

三、ADC藥物的Linker切割及payload釋放

作為靶向抗體和小分子毒素payload的連接子，Linker的重要性不言而喻。根據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)的水解方式，通常可分為“可切割連接子"和“不可切割連接子"兩種形式。

【ADC藥物的可切割連接子類型】

可切割連接子被設(shè)計(jì)為對(duì)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境差異（pH、氧化還原電位等）表現(xiàn)出化學(xué)不穩(wěn)定性，或者可以被特定的溶酶體（lysosome）酶切割?；瘜W(xué)切割連接子通常包括酸裂解（腙鍵/碳酸脂）和可還原裂解（二硫鍵）。前者對(duì)體內(nèi)酸性環(huán)境高度敏感，利用內(nèi)體（endosome,PH 5.5~6.2）和溶酶體（PH 4.5~5.0)的酸性環(huán)境觸發(fā)連接子的斷裂，隨后釋放有效載荷。該類型連接子藥物血漿穩(wěn)定性差、半衰期短，且只能使用中度細(xì)胞毒性的payload。如有研究發(fā)現(xiàn)，具有腙鍵的連接子在生理?xiàng)l件下（PH=7.4，37℃）也可以發(fā)生緩慢水解，從而導(dǎo)致毒性載荷的緩慢釋放，典型的就是曾被召回的“吉妥單抗“藥物。作為另一類可還原連接子二硫鍵則是具有還原型谷胱甘肽依賴性，細(xì)胞質(zhì)中谷胱甘肽水平（1–10 mmol/L）較血漿（～5μmol/L）中更高，因此還原型二硫鍵連接子在血液循環(huán)中相對(duì)穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原裂解二硫鍵連接子以釋放有效載荷。該種方式的連接子切割通常其大部分有效載荷不帶有自由巰基，可以與自-焚型單元接上自由巰基后，再形成二硫鍵。

另一種常見的可切割連接子是酶裂解形式連接子。即通過(guò)利用細(xì)胞中獨(dú)-特的高濃度水解酶來(lái)切割并釋放藥物，包括多肽類（Polypeptide）、葡萄糖苷酶類（Glucosidase）、磷酸酶（Phosphatase）、硫酸酯酶（Sulfatase）及天冬酰胺內(nèi)肽酶（萊古酶，Legumain）等連接子，其中多肽類連接子是利用細(xì)胞內(nèi)吞作用將ADC藥物內(nèi)化，進(jìn)而借助肝溶酶體中的組織蛋白酶來(lái)選擇性地裂解連接子。目前已知組織蛋白酶B（Cathepsin B）可特異性的切割常見的陽(yáng)性藥物德曲妥珠單抗（Enhertu，DS8201）的四肽連接子GGFG和二肽VC連接子。作為酶可連接型連接子，其穩(wěn)定性較酸裂解及GSH可切割型連接子更穩(wěn)定，通常與自-焚型結(jié)構(gòu)結(jié)合使用，是目前較為常見的連接子類型。

由上可知，可切割連接子具有多種類型，因此，選擇合適的體系進(jìn)行切割對(duì)于試驗(yàn)的順利推行具有重要意義！目前常見的payload釋放的體外試驗(yàn)系統(tǒng)有酸化肝勻漿液（Liver Homogenate，PH 5.0-6.0）、酸化肝S9（Liver S9 Fraction，PH 5.0-6.0）、肝溶酶體（Liver lysosomes）、腫瘤細(xì)胞（Tumor Cells）、純化的組織蛋白酶B（Cathepsin B）、組織蛋白酶M（Cathepsin M）、組織蛋白酶L（Cathepsin L）、葡萄糖醛酸酶（Glucuronidase）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、天冬酰胺內(nèi)肽酶（萊古酶，Legumain）等，應(yīng)針對(duì)不同連接子類型選擇合適的體系。

IPHASE為助力客戶進(jìn)行payload釋放試驗(yàn)，研發(fā)并生產(chǎn)了人、猴、犬、大鼠、小鼠等多個(gè)種屬的酸化肝勻漿液、肝S9、溶酶體及組織蛋白酶B等產(chǎn)品，并進(jìn)行了相應(yīng)質(zhì)控。以食蟹猴肝溶酶體為例，IPHASE使用終濃度1uM的組織蛋白酶B陽(yáng)性藥物Z-RR-AMC進(jìn)行代謝試驗(yàn)，輔以IPHASE自研溶酶體代謝緩沖液（Catabolic buffer），在PH5.0的環(huán)境下使用LC-MS/MS儀器于37℃下分別采集0，30，60，90及120min下Z-RR-AMC的剩余量，其中肝溶酶體的蛋白濃度為0.5mg/ml，發(fā)現(xiàn)孵育30min后Z-RR-AMC藥物代謝量大于90%，說(shuō)明IPHASE食蟹猴肝溶酶體中組織蛋白酶B具有高活性！同時(shí)，IPHASE也正在開發(fā)肝溶酶體及組織蛋白酶B對(duì)于陽(yáng)性藥物德曲妥珠單抗（Enhertu，DS8201）的切割體系，以完善對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)！

【ADC藥物的不可切割連接子】

繼了解了可切割連接子類型后，還有一種是不可切割連接子。不可切割連接子依賴于細(xì)胞質(zhì)和溶酶體蛋白酶對(duì)ADC抗體成分的完-全降解，并最終釋放與降解抗體衍生的氨基酸殘基連接的有效載荷分子，包括硫醚和馬來(lái)酰亞氨基己酰基（MC）兩類，它們由穩(wěn)定的鍵組成，防止蛋白水解裂解，并確保比其可裂解的對(duì)應(yīng)物更大的穩(wěn)定性。因此，不可切割連接子提高了血漿內(nèi)的穩(wěn)定性，且降低了脫靶毒性，但其也需要腫瘤細(xì)胞高表達(dá)抗原，且偶聯(lián)藥物要有強(qiáng)的內(nèi)化能力。因此，對(duì)于不可切割連接子而言，使用酸化肝勻漿液、肝S9及溶酶體等產(chǎn)品便于較好地降解抗體部分并釋放payload。

下表為目前已公布的ADC藥物種類及其對(duì)應(yīng)的連接子和小分子毒素類型。

四、ADC藥物的payload研究

繼了解ADC藥物連接子類型后，研究另一個(gè)ADC藥物的重要組成——有效載荷（payload）至關(guān)重要！有效載荷的活性和理化性質(zhì)直接影響著ADC藥物的抗腫瘤療效。有效載荷的作用機(jī)制是決定ADC性能的一個(gè)重要因素。此外，ADC有效載荷的其他特性，如細(xì)胞毒性、免疫原性、制備和循環(huán)過(guò)程中的穩(wěn)定性、水溶性和可修飾性也很重要。一般理想的有效載荷需具備以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：

目前，常用的細(xì)胞毒性藥物效應(yīng)分子為微管抑制劑（如：auristatins、maytansinoids）、DNA損傷劑（如calicheamicin、duocarmycins、anthracyclines、pyrrolobenzodiazepine dimers）和DNA轉(zhuǎn)錄抑制劑（Amatoxin和Quinolinealkaloid (SN-38)）。

無(wú)論是哪種連接方式斷裂下的有效載荷，都需按照小分子藥物對(duì)其ADME及藥物相互作用進(jìn)行深入分析，尤其是全新或帶有部分抗體片段或部分連接子的小分子，應(yīng)按照新化合物對(duì)其進(jìn)行研究分析，深入了解其吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程，以防未知的代謝對(duì)組織產(chǎn)生額外的毒性作用。因此，對(duì)有效載荷的研究常通過(guò)全血（Blood）、血漿（Plasma）、肝勻漿液(Liver Homogenate)、肝細(xì)胞（Hepatocytes）、肝S9（Liver S9 Fraction）、肝微粒體(Liver Microsomes)及CYP重組酶（CYP Recombinase）和UGT重組酶（UGT Recombinase）等產(chǎn)品研究其藥物本身及代謝產(chǎn)物的生成，同時(shí)也需要確定其與轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)系。除此以外，作為全新的化合物，對(duì)其進(jìn)行毒理學(xué)的研究也是非常必要的，即應(yīng)對(duì)該化合物進(jìn)行體外遺傳毒理試驗(yàn)，包含但不限于細(xì)菌回復(fù)突變（Bacterial Reverse Mutation Test，即Ames Test）、使用小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y）的TK基因突變（TK Gene Mutation Test）和HPRT（HGPRT）基因突變（HPPRT Gene Mutation Test）及使用中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL）進(jìn)行試驗(yàn)的體外染色體畸變（In Vitro Chromosome Aberration Test，即CA Test）等，便于更加全面地了解該化合物的毒性影響！

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，不擔(dān)擁有人、猴、犬、大鼠、小鼠等多種屬多類別的自研產(chǎn)品，且對(duì)每種產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格把控，為客戶提供最佳的使用感。以血漿產(chǎn)品為例，IPHASE為更好地服務(wù)客戶，將血漿產(chǎn)品分為普通血漿、PPB專用血漿、血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)專用血漿及PPB和穩(wěn)定性均經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的血漿，不同適用性產(chǎn)品使用不同小分子陽(yáng)性藥物進(jìn)行驗(yàn)證。其中，PPB專用血漿使用終濃度為5uM的華法林，使用IPHASE自研平衡透析裝置或快速平衡透析裝置，驗(yàn)證不同種屬下血漿的PPB結(jié)合率，將滿足要求的批次分別記錄，根據(jù)客戶需求進(jìn)行售賣，減少了客戶的驗(yàn)證時(shí)間和試驗(yàn)誤差，大大縮減了客戶試驗(yàn)周期。以下為IPHASE技術(shù)人員使用快速平衡透析裝置以SD大鼠血漿進(jìn)行的PPB試驗(yàn)，使用華法林為陽(yáng)性藥物，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中振蕩孵育6小時(shí)。其中，Rat-6h-PBS是陰性對(duì)照組，Rat-6h是試驗(yàn)組，結(jié)果顯示其血漿蛋白結(jié)合率高于99%，滿足大鼠血漿蛋白結(jié)合率≥98%的要求。

綜上所述，作為具有精準(zhǔn)靶向性、減少等正常細(xì)胞損害及可克服耐藥性的新型腫瘤治療藥物ADC，已逐步成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱門方向之一。因此，完整的非臨床研究對(duì)其至關(guān)重要，以下為IPHASE/匯智和源可為廣大ADC藥研發(fā)客戶提供的完整體外非臨床研究“一站式"解決方案產(chǎn)品，以期同廣大客戶一起，更好的為新藥研發(fā)貢獻(xiàn)力量！

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