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多功能酶標(biāo)儀靈敏度影響因素探究

來(lái)源:迪圖(上海)生物科技有限公司   2023年08月09日 19:44  

現(xiàn)在,多功能酶標(biāo)儀基本上是每個(gè)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)科研設(shè)備。市場(chǎng)上多功能酶標(biāo)儀品牌主要有Bio-Tek、BMG、MD、PE、Tecan等。每個(gè)品牌都有自己的特色和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品。而各品牌廠家在對(duì)自己產(chǎn)品性能-比如說(shuō)檢測(cè)靈敏度的描述時(shí),除了表征光吸收值的OD值參數(shù)外,像熒光檢測(cè)靈敏度、發(fā)光檢測(cè)靈敏度等,卻往往沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的方式和定義(名稱等)。這對(duì)用戶在選購(gòu)酶標(biāo)儀時(shí)進(jìn)行儀器間性能的對(duì)比會(huì)帶來(lái)一定的困惑。我們來(lái)看看市場(chǎng)上的優(yōu)勢(shì)品牌在對(duì)熒光檢測(cè)靈敏度這一參數(shù)的不同的描述:





   ,對(duì)于靈敏度的描述,主要有“Sensitivity”和“Detection Limit”兩種說(shuō)法,我們分別來(lái)看它們的定義:
       A: Detection Limit: 檢出限,這里有兩種理解:分析方法檢出限儀器檢出限


       1.分析方法的檢出限:國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)對(duì)檢出限的規(guī)定:對(duì)各種光學(xué)分析方法,可測(cè)量的最小分析信號(hào)XL以下式表示:

  • XL=Xb+kSb

  • 式中Xb―空白多次測(cè)定的平均值(n≥20)

  • Sb-空白多次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差

  • k-根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)(IUPAC規(guī)定k=3,此時(shí)的置信水平為90%)。為了提高檢出限的可靠性,人們還提出了保證檢出限(Limit of Guaranteed Detection)的概念,也就是上述DL公式中k=6時(shí)的檢出限。


       2.儀器檢出限:用于評(píng)價(jià)儀器的檢測(cè)能量,即:相對(duì)應(yīng)背景,儀器可靠檢測(cè)的最小信號(hào),通常用信噪比S/N來(lái)表示,為S/N≥K,根據(jù)置信度概念,K可取2或3,為合理的賦予值。

       B: Sensitivity:靈敏度。對(duì)于靈敏度概念而言,在IUPAC的定義是:方法的靈敏度m表示被測(cè)組分濃度或含量改變一個(gè)單位時(shí)所引起的分析信號(hào)的變化,即m=dX/dc。其中X為分析信號(hào),c為濃度或含量。在分析方法的校正曲線上,一般可以認(rèn)為靈敏度就是分析校正曲線的斜率。曲線斜率越大,表示靈敏度越高。但在儀器參數(shù)中所說(shuō)的“Sensitivity”并不是表示這一概念,而是具體指的是“DL(Detection Limit)或LOD(Limit Of Detection)”,比如BMG在Sensitivity的注解中就明確說(shuō)明指的是“LOD”。如果上述(表中)參數(shù)描述的“Detection Limit”(Tecan/MD/PE)指的是“方法檢出限”且“Sensitivity”(BMG/Bio-Tek/Thermo)指的是“LOD”時(shí),則Sensitivity=LOD=DL=Detection Limit。雖然描述詞不同,但是概念是相同的,其參數(shù)可以直接比較。


       目前從各廠家公開的資料中,只有BMG明確說(shuō)明采用國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)去例明參數(shù)。也只有BMG公司在參數(shù)中明確寫明了其Sensitivity的定義,包括定義、詳細(xì)的測(cè)定條件等。例如在BMG最新推遲的高性能漸變?yōu)V片型光柵多功能酶標(biāo)儀CLARIOstar的參數(shù)描述中,其FI(熒光)頂讀的靈敏度為FI Filters (top) < 0.4 pM (< 8 amol/well Fluorescein, 384sv, 20 μL),就在參數(shù)后面明確寫明了測(cè)試靈敏度時(shí)的方法:采用熒光素(Fluorescein)為底物做6點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用的是384 Small Volume微孔板,20μL的檢測(cè)體系。這里要清楚知道,測(cè)定參數(shù)時(shí)采用的微孔板類型以及檢測(cè)體系的體積非常重要。因?yàn)椴煌臈l件,其靈敏度計(jì)算結(jié)果是不一樣的。下面表2為各酶標(biāo)儀廠家的網(wǎng)站的參數(shù)資料:





      每個(gè)廠家都有不同的標(biāo)準(zhǔn)去定出其檢測(cè)靈敏度。一般會(huì)把所用的檢測(cè)濃度和質(zhì)量寫出來(lái),但也有些廠家或型號(hào)只例出濃度單位,例如:Bio-Tek Neo,MD SpectraMax M5/M3等。要全面比較檢測(cè)靈敏度,其實(shí)要配合濃度、質(zhì)量和檢測(cè)體積幾個(gè)要數(shù)作考慮。如果只有濃度(M),那實(shí)際檢測(cè)的體積是多少?200μl?100μl或是20μl?不同的體積會(huì)使實(shí)際檢測(cè)的質(zhì)量不同,這可以是十倍或更多的差別。

       除此之外,統(tǒng)一性的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也很重要。例如:BMG所有型號(hào)的頂讀熒光每次都會(huì)用384 small volume微孔板,并以20μl的體積進(jìn)行檢測(cè)。從表2中可以看到由中端研究型的FLUOstar Omega到  的PHERAstar FS都是用統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)去量度和顯示其靈敏度。如果型號(hào)間的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不一,如Tecan入門型號(hào)F200和高型號(hào)F500的參數(shù),前者是用100μl做出的;后者是用10μl做出的。這樣用戶會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣現(xiàn)象 – 就是單看濃度,F(xiàn)200(0.85pM)入門型好像比F500(1pM)高 型號(hào)更靈敏!當(dāng)然用戶也會(huì)有疑問(wèn),為什么較低端F200比 的F500要多用10倍體積?大家同樣是384孔板,為什么檢測(cè)的體積標(biāo)準(zhǔn)不一樣呢?那是否那100μl做出來(lái)的參數(shù)用20μl時(shí)可以做出同樣的靈敏度(85 amol)?這相信值得用家去思考一下。

       BMG的所有參數(shù)是根據(jù)IUPAC標(biāo)準(zhǔn)去檢測(cè)出來(lái),所用的方法、體積、微孔板、濃度和質(zhì)量等,都清楚例明。在384孔板中一貫采用20μl體積是因?yàn)檫@是接近實(shí)際實(shí)驗(yàn)的情況。有些廠家所用的檢測(cè)體積與現(xiàn)實(shí)情況其實(shí)有差距,例如Biotek的Synergy 2熒光參數(shù)標(biāo)示為:“Fluorescein 1 pM typical (0.1 fmol/well 384-well plate) – Top”,雖然廠家沒(méi)有寫出來(lái),但只要小心計(jì)算,可得出384孔板時(shí)的參數(shù)是用100μl的體積去做檢測(cè)。實(shí)際上,市場(chǎng)上的384孔板的每孔體積一般只有約110μl (例如:CORNING),而微孔板廠家推薦使用體積為20μl -80μl。如果用100μl去做檢測(cè)是有點(diǎn)不太現(xiàn)實(shí),因?yàn)轶w積太滿會(huì)令孔內(nèi)液體在檢測(cè)移動(dòng)過(guò)程中比較容易淺出,這也使孔板在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)法使用振動(dòng)功能去搖勻孔內(nèi)的樣本,影響檢測(cè)結(jié)果。再者,使用384孔板的原因除了因?yàn)楦咄客?,更重要的是想用更小的樣本和試劑體積。如果在384孔板上要用到100μl的試劑樣本,那跟原來(lái)想節(jié)省成本的原意就背道而馳了。當(dāng)然,檢測(cè)體積愈小,對(duì)儀器的檢測(cè)靈敏度要求愈高,對(duì)廠家挑戰(zhàn)也愈大。但BMG寧可放棄用較大體積做出來(lái)的漂亮參數(shù),也要忠于實(shí)際操作,用小體積做出參數(shù)給客戶參考。事實(shí)上,即使是BMG最入門的Optima系列的化學(xué)發(fā)光和熒光酶標(biāo)儀,也被客戶用來(lái)發(fā)表了超過(guò)110份Nature或Nature Publishing Group的文章,其優(yōu)良的性能實(shí)際是不容懷疑。

       綜合以上各方面,在對(duì)酶標(biāo)儀的參數(shù)進(jìn)行對(duì)比時(shí),單位的統(tǒng)一非常重要,同時(shí)測(cè)定參數(shù)時(shí)采用的條件同樣重要。對(duì)于眾多廠家的儀器,其實(shí)很難用一個(gè) 一樣的方法去比較,因?yàn)椴煌瑥S家所用的條件都不一樣。畢竟儀器的性能和表現(xiàn)是要用家使用出來(lái),而不只是靠把參數(shù)寫得漂亮。

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