摘要：本應(yīng)用簡報介紹了用于分析煙草中農(nóng)藥殘留的多組分分析方法的開發(fā)與優(yōu)化。該方法包括使用 Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取試劑盒進(jìn)行樣品萃取，隨后使用Agilent Captiva 增強(qiáng)型基質(zhì)去除-低色素含量干性基質(zhì) (EMR-LPD) 進(jìn)行通過式凈化，然后進(jìn)行 LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用和 氣質(zhì)聯(lián)用儀GC/MS/MS分析。新開發(fā)的方法在分析煙草中的大量農(nóng)藥時表現(xiàn)出高基質(zhì)去除率和可接受的目標(biāo)分析物定量結(jié)果，不合格率非常低。在煙草的分析中，300 多種適合 LC 和 GC 分析的農(nóng)藥獲得了優(yōu)異的方法定量結(jié)果，超過 95%的目標(biāo)分析物平均回收率為 70%–120%，且超過 98% 的目標(biāo)分析物平均 RSD 低于20%。通過干燥殘渣重量進(jìn)行基質(zhì)去除評估，結(jié)果表明，煙草粉共萃取物的去除率約為 60%。通過式凈化被證明是一種省時省力的簡單方法。

前言煙草是一種重要經(jīng)濟(jì)作物，消費(fèi)范圍遍及全球。種植者為了保持作物質(zhì)量和產(chǎn)量，會在種植、儲存和運(yùn)輸過程中施用農(nóng)藥防治病蟲害。公眾因消費(fèi)煙草而暴露于農(nóng)藥的問題已經(jīng)在全球范圍內(nèi)引起高度關(guān)注。因此，監(jiān)測煙草中的農(nóng)藥殘留需要采用可靠的分析方法進(jìn)行安全性評估，以符合 CORESTA 規(guī)定的指導(dǎo)性殘留量 (GRLs)[1]。煙草是一種復(fù)雜的干性基質(zhì)，含有多種成分，包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪酸、蠟質(zhì)、色素、生物堿和尼古丁[2,3]。復(fù)雜的基質(zhì)使樣品前處理難以同時實(shí)現(xiàn)多組分農(nóng)藥萃取和基質(zhì)去除。常用的樣品前處理方法包括使用 QuEChERS 或改進(jìn)QuEChERS 萃取，隨后進(jìn)行分散式 SPE 凈化[4,6]。配備 Carbon S 小柱的 Captiva EMR 采用通過式凈化方法進(jìn)行快速高效的樣品基質(zhì)去除。Captiva EMR-普通色素干性基質(zhì)(EMR-GPD) 和 EMR-低濃度色素干性基質(zhì) (EMR-LPD) 小柱尤其適用于復(fù)雜的植物干性基質(zhì)。兩種小柱均包含安捷倫吸附劑 Carbon S 和 Captiva EMR-Lipid，并以優(yōu)化的配方與N-丙基乙二胺 (PSA) 和 C18 混合。Captiva EMR-Lipid 吸附劑可提供高選擇性和高效脂質(zhì)去除，而 PSA 吸附劑則可高效去除脂肪酸和其他酸，Carbon S 吸附劑可高效去除色素，EC-C18 可進(jìn)一步凈化疏水基質(zhì)。混合配方經(jīng)過精心開發(fā)和優(yōu)化，為具有不同水平色素成分的復(fù)雜干性基質(zhì)提供了更出色的基質(zhì)去除率與目標(biāo)分析物回收率之間的平衡。對于普通色素干性基質(zhì)，通常推薦使用 Captiva EMR-GPD，而對于低濃度色素干性基質(zhì)，則建議使用 Captiva EMR-LPD。本研究開發(fā)出一種在 QuEChERS 萃取后使用 Captiva EMR-LPD通過式凈化的樣品前處理方法，用于對煙草中的 300 多種常見農(nóng)藥進(jìn)行 LC/MS/MS 和 GC/MS/MS 分析。還對該新型凈化方法與傳統(tǒng)的分散式 SPE (dSPE) 凈化進(jìn)行了全面比較。

實(shí)驗部分化學(xué)品與試劑農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo) (IS) 以混標(biāo)儲備液的形式購自安捷倫科技公司（貨號 5190-0551）和 Restek (Bellefonte, PA, U.S.A.)，或以單標(biāo)儲備液或粉末的形式購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO,U.S.A.)。HPLC 級乙腈 (ACN) 購自 Honeywell (Muskegon, MI,U.S.A.)。試劑級乙酸、乙酸銨和氟化銨也購自 Sigma-Aldrich。溶液與標(biāo)準(zhǔn)品用 1:1 ACN/水或 ACN 配制濃度為 10 µg/mL 的標(biāo)樣加標(biāo)溶液（包括 LC 和 GC 標(biāo)樣加標(biāo)溶液）和 IS 加標(biāo)溶液，并在 -20 °C的冰箱中保存。標(biāo)樣和 IS 加標(biāo)溶液使用前在室溫下解凍并渦旋，使用后重新放回原處儲存。在 990 mL 乙腈中加入 10 mL 冰乙酸，制備含 1% 乙酸的乙腈萃取溶劑，并于室溫下儲存。

儀器與材料LC/MS/MS 研究使用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜與 Agilent6490 三重四極桿 LC/MS 的聯(lián)用系統(tǒng)。1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)包括 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A)、Agilent 1290Infinity 自動進(jìn)樣器 (G4226A) 和 Agilent 1290 Infinity 柱溫箱(G1316C)。聯(lián)用的 6490 三重四極桿 LC/MS 配備安捷倫噴射流電噴霧離子源。采用 Agilent MassHunter Workstation 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。GC/MS/MS 研究使用 Agilent 8890 GC 與 Agilent 7000E 三重四極桿 GC/MS 系統(tǒng) (GC/TQ)。GC 配置有 Agilent 7693A 自動液體進(jìn)樣器 (ALS) 和 150 個瓶位的樣品盤。系統(tǒng)使用多模式進(jìn)樣口 (MMI)。使用由安捷倫吹掃 Ultimate 接頭 (PUU) 連接的兩根相同的 15 m 柱實(shí)現(xiàn)柱中反吹配置，并由 Agilent 8890 氣路反吹模塊 (PSD) 控制。有關(guān) GC/TQ 配置，請參見 Andrianova 撰寫的安捷倫應(yīng)用簡報[7]。在動態(tài) MRM (dMRM) 模式下采集數(shù)據(jù)。采集方法為保留時間鎖定法，以匹配 Agilent MassHunter農(nóng)藥與環(huán)境污染物 MRM 數(shù)據(jù)庫 (P&EP 4) 中的保留時間，該數(shù)據(jù)庫用于無縫創(chuàng)建 MS 方法。采用 MassHunter Workstation軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

樣品前處理中使用的其他儀器包括：Centra CL3R 離心機(jī)(Thermo IEC, MA, U.S.A.)、Geno/Grinder (SPEX, NJ, U.S.A.)、Multi Reax 試管振蕩器 (Heidolph, Schwabach, Germany)、移液管和重復(fù)用移液器 (Eppendorf, NY, U.S.A.)、安捷倫正壓48 孔處理裝置 (PPM-48)（貨號 5191-4101）、Agilent BondElut QuEChERS EN 萃取試劑盒（貨號 5982-5650）、AgilentCaptiva EMR-LPD 小柱，6 mL（貨號 5610-2092）、AgilentBond Elut QuEChERS EMR-Lipid 除脂萃取鹽包、3.5 g 無水MgSO4（貨號 5982-0102）以及陶瓷均質(zhì)子，50 mL 管，100/包（貨號 5982-9313）。

儀器條件表 1 列出了 LC/MS/MS 條件。有關(guān)目標(biāo)分析物的動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測 (dMRM) 參數(shù)，請參見 Zhao 的應(yīng)用簡報[8]。表 2 列出了GC/MS/MS 條件。有關(guān)目標(biāo)分析物的 dMRM 參數(shù)，請參見Agilent MassHunter 農(nóng)藥與環(huán)境污染物 MRM 數(shù)據(jù)庫 (P&EP 4)（部件號 G9250AA）。圖 1 顯示了采用 QuEChERS EN 萃取，然后用 Captiva EMR-LPD凈化制備的濃度為 100 ng/g 的加標(biāo)煙草粉樣品中目標(biāo)農(nóng)藥的典型 MRM 色譜圖。

樣品前處理煙草購自當(dāng)?shù)厥袌?，將煙葉碎片取出并研磨成粉末。稱取 1 g煙草粉置于 50 mL 離心管中。向每份樣品中加入 5 mL 水。然后將樣品渦旋 20 分鐘，對干性基質(zhì)進(jìn)行充分水化和平衡。按照 QuEChERS EN 方法對樣品混合物進(jìn)行萃取。使用 CaptivaEMR-LPD 6 mL 小柱凈化粗提物，并用無水 MgSO4 干燥。僅當(dāng)使用 GC 檢測以及聯(lián)合 LC 和 GC 檢測時，才需要干燥步驟。當(dāng)僅使用 LC 檢測時，可以省去干燥步驟。最終的樣品洗脫液可以直接進(jìn)樣或進(jìn)一步用水或緩沖液稀釋。然后樣品可直接進(jìn)樣至 GC/MS/MS，或在 LC/MS/MS 檢測之前進(jìn)一步稀釋。詳細(xì)的樣品前處理流程如圖 2 所示。從煙草粉中目標(biāo)分析物濃度到最終經(jīng)樣品萃取和基質(zhì)凈化的煙草粉提取物，整個樣品前處理過程的稀釋倍數(shù)為 10 倍。

方法性能評估根據(jù)以下幾個方面對開發(fā)的樣品前處理方法進(jìn)行了評估：煙草粉中的基質(zhì)去除率，目標(biāo)分析物回收率、重現(xiàn)性和基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線線性和定量限 (LOQs)。為評估回收率、重現(xiàn)性和基質(zhì)效應(yīng)，使用煙草粉制備 20 ng/g 和 100 ng/g 的預(yù)加標(biāo)質(zhì)量控制 (PR-QC) 樣品，一式六份，對應(yīng)的萃取后樣品粗提物中的濃度為 2 ng/mL 和 10 ng/mL。然后使用開發(fā)的方法制備加標(biāo)樣品和基質(zhì)空白樣品。在用水稀釋之前，在基質(zhì)空白萃取物中制備后加標(biāo) QCs (PO-QC)，對應(yīng)于 2 ng/mL 和10 ng/mL。以 2 ng/mL 和 10 ng/mL 的濃度直接對試劑空白（含 1% 乙酸的乙腈）加標(biāo)，制備溶劑標(biāo)樣，然后用水適當(dāng)稀釋。每種 QC 平行制備 6 份。使用 PR-QCs 和 PO-QCs 中相應(yīng)

目標(biāo)分析物的峰面積比計算目標(biāo)分析物回收率。使用 PR-QCs中的峰面積通過計算 RSD 確定樣品前處理方法的重現(xiàn)性。使用 PO-QCs 和溶劑標(biāo)樣中相應(yīng)目標(biāo)物的峰面積比計算目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)。通過在煙草粉基質(zhì)空白提取物中以 1、2、5、10、50、100、250、400 和 500 ng/g 的濃度進(jìn)行后加標(biāo)（在煙草中對應(yīng)的濃度為 10–5000 ng/g），對基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線線性和 LOQs 進(jìn)行評估。由保留時間和 MRM 離子對確定分析物鑒定、確認(rèn)和定量結(jié)果。

結(jié)果與討論方法開發(fā)與優(yōu)化煙草葉粉呈黃色至淺棕色。QuEChERS 萃取后的粗提物呈淺黃色，因此 Captiva EMR-LPD 是一個合適的選擇。研磨后的煙草粉非常干燥，因此每 1 g 干粉需要加入 5 mL 水性緩沖液，然后通過渦旋進(jìn)行較長時間的混合（20–30 分鐘）。由此得到水化的均質(zhì)物。