摘要本文介紹了使用 QuEChERS 快速基質(zhì)分散固相萃取結(jié)合 Agilent 1290 Infinity II-6470B三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) (LC-MS/MS) 檢測(cè)涼皮中米酵菌酸的分析方法。該方法使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，使米酵菌酸獲得了良好的峰形并與基質(zhì)組分有效分離；在樣品前處理中，使用 5% 甲酸乙腈提取，針對(duì)樣品中是否含油脂分別采用直接提取和 Agilent Bond Elut QuEChERS 分散式 SPE 試劑盒凈化，操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快速；方法檢出限和定量限分別為 5 μg/kg 和 10 μg/kg，靈敏度出色；在 2–100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，米酵菌酸的線性相關(guān)系數(shù)為 0.9998，表現(xiàn)出良好的線性；在 10–100 μg/kg 的加標(biāo)濃度下，通過(guò)兩種樣品前處理方法所得到的涼皮中目標(biāo)化合物的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，表明該方法具有出色的準(zhǔn)確度和精密度。該方法適用于定量測(cè)定涼皮中的米酵菌酸。

前言米酵菌酸 (Bongkrekic Acid, BA) 是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產(chǎn)生的一種毒素。被該毒素污染的食物可能引起人或動(dòng)物中毒，重者可致死亡[1]。米酵菌酸熱穩(wěn)定性好，即使烹飪也不易分解，是發(fā)酵玉米面制品、變質(zhì)鮮銀耳及其他變質(zhì)淀粉類制品引起食物中毒的主要原因。誤食后可造成多臟器損害、急性中毒甚至死亡，致死率高達(dá) 30%–50%，對(duì)人們的身體健康和生命安全有巨大的潛在威脅[2]。2023 年 7 月 14 日河南永城“毒涼皮事件”被證實(shí)是變質(zhì)涼皮中米酵菌酸引起的中毒，由此引發(fā)對(duì)涼皮等濕米制品中米酵菌酸檢測(cè)的關(guān)注。關(guān)于食品中米酵菌酸類化合物的檢測(cè)，GB/T 5009.189-2016[3] 使用 LC-DAD 作為分析系統(tǒng)；用 80 mL 氨化甲醇進(jìn)行提取，并用陰離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化，實(shí)驗(yàn)過(guò)程溶劑消耗量大、濃縮倍數(shù)高且效率較低。

本實(shí)驗(yàn)使用高靈敏度的 Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，基于米酵菌酸（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 1）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，含有 3 個(gè)典型羧基官能團(tuán)，呈弱酸性，因此酸性條件下能有效避免米酵菌酸的解離，增強(qiáng)其反相保留并改善質(zhì)譜響應(yīng)；結(jié)構(gòu)中含有長(zhǎng)鏈不飽和烷烴結(jié)構(gòu)，脂溶性較強(qiáng)，可采用反相色譜保留機(jī)理進(jìn)行分析。另外，考慮到?jīng)銎?huì)在表面上涂抹植物油以防止在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生粘連，因此在樣品前處理中通過(guò)鹽析除水溶性淀粉和去除脂肪。本應(yīng)用使用 5% 酸化乙腈提取后進(jìn)行鹽析萃取，并針對(duì)涂抹植物油的涼皮樣品，采用含有 C18 吸附劑的 Bond ElutQuEChERS 快速基質(zhì)分散固相萃取以去除油脂。獲得了理想的方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。

實(shí)驗(yàn)部分試劑和樣品實(shí)驗(yàn)用乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購(gòu)于北京迪馬科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于曼哈格公司(BePure)，以甲醇為溶劑，濃度為 100 µg/mL；涼皮樣品為市售產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)品制備取適量米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成濃度為 1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，逐級(jí)稀釋后備用。 

基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)樣的配制：準(zhǔn)確移取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)工作液，用經(jīng)過(guò)樣品前處理后的基質(zhì)空白液進(jìn)行稀釋，分別得到濃度為 2、5、10、20、50、100 ng/mL 的校準(zhǔn)標(biāo)樣。臨用現(xiàn)配。樣品前處理稱取涼皮樣品，加入水和陶瓷均質(zhì)子，渦旋混勻后用 5% 甲酸乙腈提??；鹽析分層后分別直接過(guò)膜進(jìn)樣和經(jīng) QuEChERS 分散式SPE 試劑盒凈化后進(jìn)樣，使用 Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分離，經(jīng) LC-MS/MS 進(jìn)行檢測(cè)。如圖 1 所示為樣品前處理操作流程。

檢出限和定量限通過(guò)空白基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來(lái)確定方法檢出限和定量限。當(dāng)加標(biāo)濃度水平為 5 μg/kg 時(shí)仍可定性檢出米酵菌酸，且信噪比 (S/N)大于 3，由此確定方法檢出限為 5 μg/kg；當(dāng)加標(biāo)濃度為 10 μg/kg時(shí)，S/N 大于 10，且回收率和精密度滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求，由此確定方法定量限為 10 μg/kg，優(yōu)于 GB/T 5009.189-2016方法的定量限 (15 μg/kg)。

加標(biāo)回收率和精密度選擇涼皮作為檢測(cè)基質(zhì)，分別將加標(biāo)濃度設(shè)置為 10、20、100 μg/kg，且每個(gè)加標(biāo)濃度設(shè) 6 個(gè)平行樣，通過(guò)基質(zhì)標(biāo)樣單點(diǎn)校正進(jìn)行定量。所得加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 結(jié)果見表 2。從表中可以看出，未經(jīng)脂肪去除凈化時(shí)，涼皮基質(zhì)中米酵菌酸的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 98.8%–102.4%和 1.7%–3.5%；經(jīng)過(guò) QuEChERS 分散式 SPE 凈化處理后，涼皮基質(zhì)中米酵菌酸的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，均有良好的準(zhǔn)確度和精密度。通過(guò)兩種處理方式所得到的涼皮基質(zhì)空白、標(biāo)樣和加標(biāo)樣品疊加色譜圖見圖 4。由圖中可以看出，經(jīng)過(guò) QuEChERS 基質(zhì)分散凈化包處理后，獲得了更出色的凈化效果，空白基線噪音明顯降低。

結(jié)論本應(yīng)用采用高靈敏度的 Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS/MS)，通過(guò) Poroshell 120 EC-C18 色譜柱使米酵菌酸獲得了良好的峰形并與其他基質(zhì)組分得到有效分離。該方法針對(duì)未加油的涼皮或其他不含油的食品基質(zhì)，使用 5% 甲酸乙腈直接提取鹽析萃取、過(guò)膜后上機(jī)檢測(cè)；對(duì)于含有一定油脂的樣品，在提取后使用 Agilent Bond Elut QuEChERS 分散式 SPE 試劑盒實(shí)現(xiàn)快速、高效的凈化，以減少對(duì)儀器的污染并延長(zhǎng)色譜柱使用壽命。與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中的樣品前處理過(guò)程相比，該方法更加簡(jiǎn)便、快速。在 2–100 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)，米酵菌酸線性相關(guān)系數(shù)為 0.9998，表現(xiàn)出良好的線性；方法檢出限為 5 μg/kg，定量限為 10 μg/kg，具有出色的靈敏度；在 10、20、100 μg/kg 的加標(biāo)濃度下，直接提取與經(jīng)過(guò) QuEChERS 分散式 SPE 凈化處理時(shí)，涼皮基質(zhì)中米酵菌酸的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，均表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確度和精密度。該方法適用于定量測(cè)定涼皮中的米酵菌酸。