摘要本應(yīng)用簡報采用一種基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜平臺的數(shù)據(jù)非依賴型采集方法，結(jié)合固相萃取凈化和農(nóng)藥高分辨精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫與譜圖庫查詢的多農(nóng)殘分析策略，開展 2020 年度歐盟農(nóng)藥殘留檢測能力驗證項目中關(guān)于洋蔥基質(zhì)中無清單農(nóng)藥的定性篩查和基于清單農(nóng)藥的定量篩查（EUPT-SM12 和 EUPT-FV22）?；跉W盟定量篩查清單中適合電噴霧離子化的 173 種農(nóng)藥，在洋蔥基質(zhì)中對該分析方法進行驗證。結(jié)果表明，該方法對其中 165 種農(nóng)藥的篩查限、定量限、線性、加標(biāo)回收率和精密度均較為滿意，滿足對這些農(nóng)藥定性篩查和準(zhǔn)確定量測定的方法合格性要求。應(yīng)用所述方法對 SM12 和FV22 樣品進行測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所篩查出的農(nóng)藥化合物與組織方添加的農(nóng)藥一致，無假陽性和假陰性，并且對于要求定量篩查的 FV22 樣品的定量結(jié)果準(zhǔn)確，表明該方法能夠滿足歐盟關(guān)于農(nóng)藥非靶向定性篩查和基于清單化合物的定量篩查的要求。

前言目前有超過 1000 種農(nóng)藥用于防治農(nóng)作物的病蟲草害，不當(dāng)使用會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留于各類農(nóng)產(chǎn)品中，可能對消費者的健康構(gòu)成潛在威脅。因此，食用農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留一直是全球監(jiān)管機構(gòu)監(jiān)測的重點。為確保監(jiān)測結(jié)果的可靠性，依據(jù)歐盟法規(guī) 396/2005/EC，所有在歐盟法規(guī)控制框架下的農(nóng)殘檢測實驗室每年均需要參加由歐盟健康與消費者保護委員會 (DG-SANCO) 組織的農(nóng)殘能力測試。歐盟參比實驗室 (EURL) 根據(jù)歐盟法規(guī) Reg. 882/2004/EC代表 DG-SANCO 組織年度關(guān)于農(nóng)殘檢測的能力驗證項目（簡稱EUPT）。該驗證項目有助于了解相關(guān)檢測實驗室的檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量、準(zhǔn)確度以及各實驗室間的可比性。歐盟域外實驗室經(jīng) DGSANCO 許可后可以參加該能力驗證項目。目前，色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法仍是農(nóng)殘檢測的方法。但使用該方法時，需要針對每種化合物預(yù)先編輯其待采集的特征離子對；再者，由于分辨率較低，使得利用三重四極桿質(zhì)譜進行檢測時可能出現(xiàn)假陽性；另外，能夠檢測的農(nóng)藥數(shù)量也受到儀器掃描速率的限制，且無法對采集清單之外的農(nóng)藥進行檢測。因此，為了提高復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測能力，并實現(xiàn)對采集清單外的農(nóng)藥進行回溯性篩查，我們在過去十余年中一直致力于采用色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用手段來開展農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留篩查。相繼開發(fā)出用于蘋果、番茄、紫甘藍、芒果、香蕉、棉籽殼等各類農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的高通量定性篩查與準(zhǔn)確定量方法[1-4]。

本應(yīng)用簡報介紹了 2020 年度參與 EUPT 關(guān)于洋蔥基質(zhì)中的農(nóng)藥篩查與測定的結(jié)果?；?2020 年度歐盟定量篩查清單中適合電噴霧離子化的 173 種農(nóng)藥，在洋蔥基質(zhì)中對實驗室開發(fā)的多農(nóng)殘同時定性篩查與準(zhǔn)確定量的策略與方法[2] 進行篩查限、定量限、線性、加標(biāo)回收率和精密度等方法性能評價；然后利用該方法對EUPT-SM12 和 EUPT-FV22 樣品進行篩查。所篩查出的農(nóng)藥種類和定量結(jié)果與歐盟組織方公布的添加農(nóng)藥種類及含量一致，表明所開發(fā)的多農(nóng)殘篩查與定量方法準(zhǔn)確可靠，能夠滿足歐盟對農(nóng)藥殘留的非靶向篩查和準(zhǔn)確定量監(jiān)測的要求。

實驗部分試劑和樣品所有 173 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購自天津阿爾塔科技有限公司，純度≥ 98%；甲酸和醋酸銨均為 LC/MS 級，購自美國 Merck 公司；乙腈和甲苯均為色譜純，購自美國 Fisher 公司；乙酸、無水硫酸鈉和氯化鈉均為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司；EUPT-SM12（簡稱“SM12”）和 EUPT-FV22（簡稱“FV22”）樣品由 EUPT 組織方提供。用于方法學(xué)評價的洋蔥樣品基質(zhì)購自本地市場。

儀器和設(shè)備采用 Agilent 1290 Infinity II 二元液相色譜系統(tǒng)對農(nóng)藥化合物進行超高效分離。該色譜系統(tǒng)配備如下安捷倫模塊：1290 Infinity II 二元高壓梯度泵、1290 Infinity II 自動進樣器和 1290 Infinity II 柱溫箱。色譜柱的流出液轉(zhuǎn)入 Agilent 6545A 四極桿飛行時間質(zhì)譜儀進行檢測。實驗所用的 Carbon/NH2 固相萃取小柱（500 mg/500 mg，部件號 12252202）為美國安捷倫公司產(chǎn)品，所用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm，部件號861775-902）。

定性篩查EUPT 組織方提供的 SM12 樣品僅要求提供定性篩查結(jié)果，F(xiàn)V22樣品則要求基于 EUPT 提供的清單同時提供定性和定量篩查結(jié)果。因此，實驗首先對這兩種樣品按上述樣品前處理方法進行處理，得到待測溶液；然后采用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜平臺在全離子 MS/MS 模式下采集數(shù)據(jù)，對采集得到的結(jié)果進行定性篩查。對于 SM12 樣品，依據(jù)實驗室現(xiàn)有的農(nóng)藥化合物精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫與譜庫（農(nóng)藥 PCDL 庫，包含超過 810 種化合物）進行分子式查找，同時選擇碎片離子進行確認(rèn)。對于 FV22 定量篩查樣品，則在實驗室現(xiàn)有的農(nóng)藥 PCDL 庫的基礎(chǔ)上，建立針對 FV22 篩查清單的 PCDL 子庫，然后利用該 PCDL 子庫進行母離子（定量離子）查找以及碎片離子確認(rèn)。定性篩查指標(biāo)參考SANTE/12682/2019 指南[6] 并進行適當(dāng)調(diào)整，化合物的確認(rèn)需要滿足以下條件：包括 1 個母離子和至少 1 個碎片離子，且這些離子的質(zhì)量偏差需要在 10 ppm 以內(nèi)；母離子與碎片離子共流出，且保留時間與庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在相同色譜條件下的保留時間偏差在0.35 min 以內(nèi)。對于質(zhì)量偏差在 5–10 ppm 以內(nèi)的化合物，則需進一步人工查驗確認(rèn)。方法的篩查限 (SDL) 基于上述篩查指標(biāo)要求，采用本地市場采購的無陽性檢出的洋蔥樣品作為空白基質(zhì)，分別以 1、5、10、25和 50 µg/kg 的濃度水平進行 173 種農(nóng)藥的加標(biāo)測試。每個濃度水平做 20 組平行實驗，經(jīng)圖 1 所示的樣品提取與凈化過程，在本文所述的色譜和質(zhì)譜條件下進行測定，并按上述化合物確認(rèn)需要滿足的條件進行篩查閾值的設(shè)置。如果某個濃度水平下有 95%或以上的樣品中篩查出某種目標(biāo)化合物，則認(rèn)為該濃度為此化合物的篩查限。

定量測定對于定量限和線性范圍的確定，首先按照圖 1 制備空白基質(zhì)，在最后一步溶解殘渣時向其中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成1、5、10、25、50、100、200 μg/kg 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正溶液，然后進行樣品測定。選擇分子加合離子峰（母離子）計算 S/N。將 S/N 滿足 ≥ 10 所對應(yīng)的低加標(biāo)濃度水平定為目標(biāo)化合物的定量限 (LOQ)；并以母離子的提取色譜峰面積對添加濃度進行作圖，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。采用空白洋蔥樣品作為驗證基質(zhì)，分別在 1 × LOQ、2 × LOQ 和10 × LOQ 三個濃度水平進行加標(biāo)回收實驗，每個濃度水平平行測定 5 次，用以評估方法的準(zhǔn)確度和精密度。對于定性篩查小節(jié)中在 FV22 樣品中定性篩查得到的農(nóng)藥，以上述基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正曲線對篩查到的農(nóng)藥進行準(zhǔn)確定量。

結(jié)果與討論2020 年度歐盟農(nóng)殘能力驗證中的 FV22 項目是基于歐盟公開的農(nóng)藥清單（2020 年度的清單包括 208 種強制農(nóng)藥清單和 36 種自愿農(nóng)藥清單，共 244 種）的篩查與準(zhǔn)確定量。利用本實驗室基于LC-QTOF/MS 平臺所開發(fā)的檢測方法，首先開展針對歐盟清單化合物的定性和定量篩查方法評價。在上述包含 244 種化合物的清單中，利用根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)判斷適合電噴霧正離子模式離子化特征的 173 種農(nóng)藥，對定性和定量篩查方法的性能進行評價。其它71 種化合物適合電噴霧負離子模式離子化或 EI 離子化，不在本文討論的范圍內(nèi)。

方法的篩查限 (SDL)、定量限 (LOQ) 與標(biāo)準(zhǔn)曲線按照前述篩查限測定的方法，得到 173 種農(nóng)藥化合物的篩查限如圖 2A 中以“×”標(biāo)記的數(shù)據(jù)點所示。其中 96.5%（167 種）的農(nóng)藥的篩查限在 1–5 µg/kg 范圍內(nèi)，且有 132 種 (76.3%) 農(nóng)藥的篩查限不高于 1 µg/kg。其余 6 種 (3.5%) 農(nóng)藥的篩查限相對較高，其中 5 種農(nóng)藥（保棉磷、丙硫磷、氟胺氰菊酯、甲基立枯磷和仲丁威）的篩查限在 25 µg/kg 的水平，1 種農(nóng)藥（異噁唑草酮）的篩查限在 50 µg/kg 的水平。表明該方法對于測試清單中適用電噴霧正離子化的絕大部分農(nóng)藥的篩查靈敏度較高，滿足歐盟對于這些農(nóng)藥篩查的 10 µg/kg 的一律標(biāo)準(zhǔn)，以及針對個別化合物（例如樂果、氧樂果和毒死蜱等）的更低的標(biāo)準(zhǔn) (3–5 µg/kg)。173 種農(nóng)藥的定量限如圖 2A 中以“o”標(biāo)記的數(shù)據(jù)點所示。從圖中可以看出，上述 SDL 在 1–5 µg/kg 范圍內(nèi)的 167 種農(nóng)藥的 LOQ均不高于 10 µg/kg 的一律標(biāo)準(zhǔn)和針對個別化合物的更低的標(biāo)準(zhǔn)；且上述篩查限較高的 6 種農(nóng)藥中的兩種（保棉磷和仲丁威）的LOQ 在 25 µg/kg 水平，其余 4 種農(nóng)藥的 LOQ 則不高于 50 µg/kg。基質(zhì)加標(biāo)溶液測定的結(jié)果表明，所考察的農(nóng)藥化合物在測定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，超過 90% 的農(nóng)藥化合物的線性回歸方程決定系數(shù) R2 均大于 0.99，個別化合物的 R2 略低于 0.99，但均大于0.98，如圖 2B 所示。