摘要：本文使用 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取凈化并結(jié)合安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀HPLC-MS/MS，建立了一種測(cè)定不同動(dòng)物源食品（豬肉、豬肝、豬腎、羊肉、牛奶、雞蛋）中潮霉素 B 的檢測(cè)方法。在 10–500 ng/L 的濃度范圍內(nèi)，使用同位素內(nèi)標(biāo)校正所得到的線性相關(guān)系數(shù)高于 0.99；各種動(dòng)物源食品中潮霉素 B 的方法檢測(cè)限為 10 μg/kg，定量限為 20 μg/kg；在加標(biāo)濃度為 20–250 ng/g 時(shí)，不同目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內(nèi)。該方法適用于多種動(dòng)物源食品中潮霉素 B 殘留的測(cè)定。

前言：潮霉素 B 是由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素。其能夠抑制蛋白質(zhì)合成，從而殺死細(xì)菌、真菌和高等真核細(xì)胞，可有效控制豬蛔蟲、食道口線蟲和毛首線蟲感染（例如，在妊娠母豬全價(jià)飼料中添加潮霉素 B，能夠保護(hù)仔豬在哺乳期間不受蛔蟲感染），同時(shí)對(duì)雞蛔蟲、雞異刺續(xù)蟲和禽封閉毛細(xì)線蟲均有良好的控制效應(yīng)[1]。GB 31650-2019[2] 中規(guī)定潮霉素 B 可用作治療，但不得在動(dòng)物性食品（可食組織、雞蛋）中檢出。因此，非常有必要建立動(dòng)物源食品中潮霉素 B 的檢測(cè)方法。GB/T 21323-2007[3] 介紹了一種檢測(cè)動(dòng)物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測(cè)定方法。該方法使用磷酸-三氯yi酸緩沖液進(jìn)行提取，并使用離子對(duì)試劑七氟丁酸降低氨基糖苷極性，然后通過 C18 固相萃取柱進(jìn)行凈化。但該方法中的七氟丁酸使用量大，成本較高，且向流動(dòng)相含有 20% 100 mmol/L 七氟丁酸會(huì)對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染。本文在該標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行了改進(jìn)。采用yi酸銨-三氯yi酸緩沖溶液進(jìn)行提取，并通過具有機(jī)理的 Bond Elut PBA 進(jìn)行固相萃取凈化，其硅膠基體上鍵合的苯硼酸官能團(tuán)對(duì)潮霉素 B 結(jié)構(gòu)中的順式-二醇官能團(tuán)具有較強(qiáng)的選擇性，在堿性條件下通過可逆共價(jià)鍵被保留，然后在酸性條件下洗脫，從而實(shí)現(xiàn)高選擇性保留和凈化效果。另外，該方法使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，僅在上機(jī)前定容溶液中加入七氟丁酸，可避免污染系統(tǒng)。由此建立了一種適用于快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)多種動(dòng)物源基質(zhì)中潮霉素 B 的方法。

實(shí)驗(yàn)部分試劑和樣品實(shí)驗(yàn)用乙腈、甲酸、七氟丁酸均為色譜純，購(gòu)于北京迪馬科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 標(biāo)準(zhǔn)品：100 μg/mL（BePure，購(gòu)于曼哈格公司，以水為溶劑）?；|(zhì)樣品為市售產(chǎn)品。儀器和設(shè)備采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜/6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS/MS) 系統(tǒng)；Agilent Vac Elut 20 位固相萃取裝置。所用其他主要設(shè)備包括 3K-15 離心機(jī)（德國(guó) Sigma 公司）和渦旋混勻器（德國(guó) IKA 公司）。色譜柱采用 Agilent Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm（部件號(hào) 695975-306）。樣品前處理采用 Agilent Bond Elut PBA（100 mg，3 mL，部件號(hào) 12102127）、Agilent ValueLab PES 微孔濾膜（0.2 μm，13 mm，部件號(hào) 5190-5273）、安捷倫陶瓷均質(zhì)子（用于 50 mL離心管，部件號(hào) 5982-9313）。溶劑和標(biāo)樣配制分別取適量的標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈:水 (50:50, V/V) 配制濃度為 10 mg/L的潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，逐級(jí)稀釋備用。校準(zhǔn)標(biāo)樣的配制：分別準(zhǔn)確移取上述適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，用 0.5%甲酸水（含 1% 七氟丁酸）稀釋成濃度分別為 10、20、50、100、200、500 和 1000 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為50 μg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。 然后向其中加入 50 g 三氯yi酸，溶解并混勻后，加水定容至 1000 mL，搖勻后備用（在 4 °C下可保存 1 個(gè)月）。

樣品前處理稱取樣品 5 g (±0.05 g) 于 50 mL 離心管中，添加一定量的內(nèi)標(biāo)；加入陶瓷均質(zhì)子，向其中準(zhǔn)確加入 5 mL 銨-三氯yi酸緩沖溶液，渦旋振蕩 5 min；以 8000 r/min 離心 5 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中；將剩余殘?jiān)?5 復(fù)提取一次，以 8000 r/min 離心 5 min 后合并上清液； pH = 8.5 (±0.2)，定容至 12 mL（將牛奶定容至 15 mL）；然后以 8000 r/min 離心 5 min，所得上清液用作備用液。將 Bond Elut PBA 固相萃取柱依次用 2 mL 乙腈、3 mL 0.5% 甲酸水、5 mL 0.2 mol/L  (pH = 8.5) 活化；取一半體積的備用液 (6 mL) 過柱（對(duì)于牛奶，則取 7.5 mL）；待樣品液全部流出之后，依次用 3 mL 0.2 mol/L  (pH = 8.5) 和 3 mL 水淋洗，并抽干 2 min；加 2 mL 0.5% 甲酸水分兩次洗脫；向洗脫液中加入 20 μL 七氟丁酸，渦旋混勻后，過 0.2 μm PES 濾膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，前處理流程圖見圖 1。

液相色譜條件儀器 Agilent 1290 Infinity II 高速泵（部件號(hào) G7120A）Agilent 1290 Infinity II 進(jìn)樣器（部件號(hào) G7167B）Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱（部件號(hào)G7116B）色譜柱 Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm流動(dòng)相 A：0.5 mmol/L 乙酸銨，0.1% 甲酸水溶液B：乙腈流速 0.3 mL/min梯度 時(shí)間 (min) B (%)0 22.0 22.1 85.1 407.0 908.0 90后運(yùn)行時(shí)間 3 min柱溫 40 °C進(jìn)樣體積 10 μL

檢測(cè)限和定量限通過空白基質(zhì)中的加標(biāo)回收試驗(yàn)來(lái)確定方法的檢測(cè)限和定量限。當(dāng)加標(biāo)濃度為 10 µg/kg 時(shí)仍可定性檢出，目標(biāo)物色譜峰的信噪比(S/N) 大于 3，由此確定該方法的檢測(cè)限為 10 µg/kg；當(dāng)加標(biāo)濃度為 20 µg/kg 時(shí)，信噪比 (S/N) 大于 10，且回收率和重現(xiàn)性均能滿足相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，由此確定該方法的定量限為 20 μg/kg?；厥章屎途芏缺緫?yīng)用選擇幾種代表性的動(dòng)物源食品，即豬肉、豬肝、豬腎、羊肉、牛奶和雞蛋，分別添加 20、50、250 μg/kg 三個(gè)濃度樣品，且每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)六個(gè)平行樣，以此驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表 2。潮霉素 B 在不同動(dòng)物源食品中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。不同動(dòng)物源食品中基質(zhì)空白和潮霉素加標(biāo)回收色譜圖見圖 3。

結(jié)論本文采用 HPLC-MS/MS 結(jié)合 Poroshell 120 EC-C8 色譜柱建立了一種檢測(cè)動(dòng)物源食品中潮霉素 B 的方法。該方法與 GB/T 21323-2007 相比，在上機(jī)前溶液中加入七氟丁酸，可大幅減少七氟丁酸的使用量并避免了離子對(duì)試劑對(duì)儀器的污染。同時(shí)，采用共價(jià)機(jī)理的 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取柱對(duì)潮霉素 B 具有高選擇性，可實(shí)現(xiàn)出色的凈化效果。該方法簡(jiǎn)便、高效，在 10–500 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性（線性相關(guān)系數(shù) R2 高于 0.99）；且靈敏度出色（檢測(cè)限為 10 μg/kg，定量限為 20 μg/kg）；不同動(dòng)物源樣品基質(zhì)中潮霉素 B 的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范圍內(nèi)，表明其具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。該方法適用于測(cè)定多種動(dòng)物源食品中的潮霉素 B 殘留。