慢性皮膚傷口，如糖尿病足潰瘍、靜脈相關(guān)潰瘍和難以愈合的手術(shù)傷口，正在影響著美國超過1050萬人的健康，并導(dǎo)致巨額的醫(yī)療保健開支，據(jù)估計，每年的費用高達(dá)250億美元以上。此外，由于免疫反應(yīng)受損，慢性傷口特別容易受到細(xì)菌感染，例如金黃色葡萄球菌（S. aureus），這會進(jìn)一步加重患者的病情。據(jù)報道，與慢性傷口相關(guān)的疾病，5年死亡率甚至超過50%，這一數(shù)據(jù)與心力衰竭的死亡率相當(dāng)，顯著體現(xiàn)了慢性皮膚傷口對患者健康和醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來的巨大負(fù)擔(dān)。

針對不愈合的皮膚傷口，目前已經(jīng)研發(fā)了多種治療方法，包括局部清潔消毒、口服抗生素，傷口清創(chuàng)、抗菌敷料，以及物理抗菌療法，如激光應(yīng)用。盡管在治療方式取得了一些進(jìn)展，但這些方法仍然存在一些缺點。例如，通常在傷口組織中形成的細(xì)菌生物膜可當(dāng)做物理屏障，它阻礙了抗生素或其他藥物穿透深部病變，從而顯著降低治療效果。另外，長期使用或濫用抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，這使得皮膚傷口治療更加困難和復(fù)雜。同時，傷口清創(chuàng)和更換敷料等侵入性操作很可能會對傷口造成二次傷害的風(fēng)險。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，最近的研究探索了具有非侵入性特性和改進(jìn)生物膜滲透能力的納米配方，旨在通過抗菌和抗炎作用促進(jìn)慢性傷口愈合。然而，這些基于納米技術(shù)的系統(tǒng)往往缺乏靶向能力或無法實現(xiàn)長期的協(xié)同效應(yīng)，從而影響了它們的治療效果。因此，需要構(gòu)建一種通過靶向和協(xié)同療法加速慢性傷口愈合的新策略。

基于此，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授團(tuán)隊設(shè)計開發(fā)了一種裝載工程一氧化氮釋放納米載體的多功能微針貼片用于慢性傷口的靶向和協(xié)同治療。相關(guān)研究成果以“Multifunctional Microneedle Patches Loaded With Engineered Nitric Oxide-Releasing Nanocarriers for Targeted and Synergistic Chronic Wound Therapy”為題發(fā)表在期刊《Advanced Materials》上。武漢大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生靳銀麗、武漢大學(xué)同仁醫(yī)院（武漢市第三人民醫(yī)院）燒傷科副主任醫(yī)師劉淑華為共同第一作者，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授、武漢大學(xué)同仁醫(yī)院（武漢市第三人民醫(yī)院）阮瓊芳教授為共同通訊作者。

該微針貼片（RE@SA-Con A/SNO MNs）是利用摩方精密 microArch® S240 （精度：10 μm）3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成的，由聚乙烯醇（PVA）、蔗糖、RE@SA-Con A/SNO納米粒子制成。RE@SA-Con A/SNO NPs修飾有刀豆球蛋白A（Con A）和NO分子并裝載抗菌物質(zhì)羅氏菌素（Reuterin）。在MNs的幫助下，納米顆粒（NPs）可以直接穿過細(xì)菌生物膜并高效遞送到傷口組織，通過Con A與細(xì)菌表面多糖之間的特異性識別靶向有害細(xì)菌，然后釋放羅氏菌素，從而達(dá)到有效的抗菌效果。此外，NPs在傷口組織中解離時持續(xù)產(chǎn)生NO，發(fā)揮強大的抗炎作用，有利于組織再生，進(jìn)一步促進(jìn)慢性傷口閉合。因此，這項工作提供了一種新型微針貼片，其中載有工程化納米粒子，旨在通過靶向和協(xié)同治療加速慢性傷口愈合。

首先使用高碘酸鈉對海藻酸（SA）進(jìn)行氧化形成醛基化海藻酸鈉（ASA），隨后，將刀豆凝集素A（Con A）與醛基修飾的SA偶聯(lián)形成海藻酸-刀豆凝集素A（SA-Con A）。同時，通過硫醇基的引入完成了NO的修飾，先制備硫醇功能化海藻酸（SA-SH），隨后，將NO與硫醇基偶聯(lián)，形成一氧化氮供體（SA-SNO）。RE@SA-Con A/SNO納米顆粒通過海藻酸-刀豆凝集素A（SA-Con A）與海藻酸-硝基化物（SA-SNO）在鈣離子（Ca2?）的交聯(lián)作用下合成。合成的RE@SA-Con A/SNO納米顆粒呈球形，通過動態(tài)光散射（DLS）測得其粒徑為255.00 ± 0.33 nm。納米顆粒的包封效率為57.65±3.72%，藥物負(fù)載效率達(dá)到21.09±1.33%。由于Ca2?的引入，顆粒的zeta電位上升至?0.23 ± 0.08 mV，表明顆粒分散均勻。隨后，進(jìn)一步分析了RE@SA-Con A/SNO納米顆粒的藥物釋放性能。結(jié)果顯示，Reuterin可持續(xù)釋放長達(dá)60小時， NO可以實現(xiàn)約12小時的持續(xù)釋放。這些結(jié)果表明，RE@SA-Con A/SNO納米顆粒具有同時長效釋放Reuterin和NO的能力。

圖2. RE@SA-Con A/SNO NPs的表征。a）RE@SA-Con A/SNO NPs的合成過程示意圖。b） SA-ConA的FTIR光譜。c）RE@SA-Con A/SNO NPs的TEM圖像。d）SA-SNO的FTIR光譜。e）RE@SA-Con A/SNO NPs的動態(tài)光散射（DLS）。f）RE@SA-Con A/SNO NPs的封裝效率和負(fù)載效率。g）RE@SA-Con A/SNO NPs的Zeta電位。RE（h）和NO（i）體外RE@SA-Con A/SNO NPs 的累積釋放。每個點代表SD ±平均值（n = 3）。

然后，通過真空輔助微成型方法制備可溶性微針貼片，并將RE@SA-Con A/SNO NPs裝載到微針貼片（RE@SA-Con A/SNO MNs）中。為便于觀察，用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記納米顆粒。可以看出，微針排列為10×10陣列，熒光標(biāo)記的納米顆粒均勻分布于微針中。這一分布通過微針截面的場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）進(jìn)一步驗證。每根微針呈錐形，高度為850 µm，底部直徑為400 µm，針間距為700 µm。微針貼片表現(xiàn)出良好的機械強度（2.14±0.35 N），成功刺入離體豬皮膚而未發(fā)生斷裂。微針在應(yīng)用5分鐘后迅速溶解，實現(xiàn)了納米顆粒的高效遞送。每片微針貼片中納米顆粒的負(fù)載量為63.75±2.42 µg，刺入皮膚后納米顆粒的遞送效率達(dá)到86.35±1.49%。此外，微針貼片體積小巧，便于穿戴于足部或手部，用于治療應(yīng)用。

RE@SA-Con A/SNO NPs的靶向性能對微針貼片清除有害細(xì)菌并促進(jìn)創(chuàng)傷愈合至關(guān)重要。首先評估了RE@SA-Con A/SNO NPs在微針中的靶向效率。經(jīng)過與金黃色葡萄球菌（S. aureus）共孵育12小時后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的RE@SA-Con A/SNO NPs能有效靶向并結(jié)合于S. aureus表面，這一結(jié)果通過FESEM圖像進(jìn)一步證實。相比之下，當(dāng)將Con A蛋白替換為牛血清白蛋白（BSA）時，納米顆粒（RE@SA-BSA/SNO-FITC NPs）失去了靶向有害細(xì)菌的能力。結(jié)果表明，RE@SA-Con A/SNO NPs的靶向能力來源于Con A與細(xì)菌表面甘露糖基和葡萄糖基殘基的特異性相互作用。

圖3. RE@SA-Con A/SNO MN貼片的表征。a）RE@SA-Con A/SNO MN的代表性明場和熒光場顯微鏡圖像。RE@SA-Con A/SNO MN橫截面（b）和單根RE@SA-Con A/SNO MNs（c）的FESEM圖像。黃色箭頭表示MN中封裝的NPs。d）RE@SA-Con A/SNO MNs插入離體豬皮膚后的代表性明場和熒光場顯微鏡圖像。e）應(yīng)用 RE@SA-Con A/SNO MNs后豬皮膚的組織學(xué)切片圖像。f）可穿戴多功能MN貼片附著在人的腳或手上而沒有皮膚穿刺的演示照片。藍(lán)色虛線方塊表示MN貼片的位置。g）代表性FESEM圖像顯示靶向細(xì)菌的 RE@SA-Con A/SNO NPs。紅色箭頭表示NPs和細(xì)菌之間的靶向界面。h）靶向細(xì)菌的 RE@SA-Con A/SNO-FITC NPs的代表性熒光場顯微鏡圖像。

隨后，進(jìn)一步評估了RE@SA-Con A/SNO MNs的體外抗菌效果。結(jié)果顯示，微針貼片與S. aureus或大腸桿菌（E. coli）共孵育后，細(xì)菌細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯破損，有效抑制了細(xì)菌生長。SYTO-9/PI染色檢測顯示，經(jīng)過RE@SA-Con A/SNO MNs處理后，S. aureus的存活率低。抑菌圈測試進(jìn)一步驗證，RE@SA-Con A/SNO MNs形成的抑菌圈直徑最大，為16.57±0.42 mm。最后，評估了微針貼片在體外清除生物膜的效果。與抗菌實驗結(jié)果一致，RE@SA-Con A/SNO MNs對生物膜的清除效果最為顯著，生物膜清除率高達(dá)78.13 ± 1.48%。這一優(yōu)異性能歸因于Reuterin和NO分子的協(xié)同抗菌作用。

圖4. RE@SA-Con A/SNO MNs的體外抗菌作用。a）RE@SA-Con A/SNO MNs處理后S. aureus的代表性FESEM顯微鏡圖像。b）與不同MN孵育24小時后S. aureus的生長的LB瓊脂平板的代表性圖像。c）應(yīng)用不同微針24小時后對S. aureus的抑制圈的代表性圖像。黑色虛線方塊表示MN貼片的應(yīng)用位置，紅色虛線圓圈表示抑制圈。d）與不同MN孵育24 小時后S. aureus的活/死測定。e）不同處理的S. aureus共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。綠色：活細(xì)菌。f）微針貼片對S. aureus的抑制圈直徑。g）S. aureus在接受不同處理24小時后在LB液體培養(yǎng)基中的OD600值。h）細(xì)菌死亡率分析。i）S. aureus在不同處理后的生物膜清除率。每個點代表SD±平均值（n = 3）。P < 0.001。

緊接著驗證RE@SA-Con A/SNO MNs的體外抗炎效果，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW264.7細(xì)胞中CD86的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示RE@SA-Con A/SNO微針顯著降低了CD86的表達(dá)水平（從12.49 ± 0.11%降至3.17 ± 0.15%），證明其具有明顯的抗炎效果。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和免疫熒光檢測與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)水平。結(jié)果表明，RE@SA-Con A/SNO微針顯著降低了RAW264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)量，進(jìn)一步證實了其優(yōu)異的抗炎作用。

圖5. RE@SA-Con A/SNO MNs在體外的抗炎作用。a）通過流式細(xì)胞術(shù)分析具有不同MN的RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)CD86熒光強度。b）不同組CD86的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。c）不同組的CD86相對表達(dá)量。不同處理后RT-qPCR測定RAW 264.7細(xì)胞中IL-6 （d）和TNF-α （e）的表達(dá)水平。f，g）不同處理后通過免疫熒光技術(shù)測定RAW 264.7細(xì)胞中IL-6的表達(dá)水平。每個點代表 SD ±平均值（n = 3）。**P < 0.01，***P < 0.001。

接下來，評估RE@SA-Con A/SNO微針的生物安全性，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和NIH-3T3細(xì)胞分別與不同濃度的RE@SA-Con A/SNO納米顆粒共孵育24小時。結(jié)果顯示，即使在100 µg/mL的高濃度下，細(xì)胞存活率仍保持在95%以上。進(jìn)一步將HUVEC和NIH-3T3細(xì)胞與不同組別的微針貼片共孵育24小時，細(xì)胞的活死染色實驗結(jié)果顯示細(xì)胞仍具有較高的存活率且未出現(xiàn)明顯凋亡（存活率>90%），這表明微針貼片具有良好的生物安全性。

細(xì)胞遷移和血管生成在創(chuàng)傷愈合中具有重要作用。通過細(xì)胞劃痕實驗和血管生成實驗表明RE@SA-Con A/SNO MNs可以顯著增加細(xì)胞遷移，并有效促進(jìn)了管狀結(jié)構(gòu)的形成及血管生成。RE@SA-Con A/SNO微針促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成的機制與其持續(xù)釋放NO有關(guān)。NO通過上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的αvβ3整合素（αvβ3 integrin）發(fā)揮作用，而該整合素是內(nèi)皮細(xì)胞生存、遷移及血管生成的重要黏附分子。綜上所述，RE@SA-Con A/SNO微針在促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成方面表現(xiàn)出優(yōu)異性能，有望加速創(chuàng)傷愈合進(jìn)程。

圖6. RE@SA-Con A/SNO MNs的細(xì)胞毒性和促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成。a）用不同MNs處理后HUVEC細(xì)胞的活/死測定。b）不同MNs處理后HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞活力分析。c）不同組處理的HUVECs遷移的代表性圖像。d）不同組處理的HUVEC細(xì)胞的遷移率。e）不同組處理的HUVEC微管形成的代表性圖像。f）HUVEC微管形成的定量分析。每個點代表 SD ±平均值（n = 3）。***P < 0.001。

然后，研究團(tuán)隊在小鼠身上建立全層皮膚傷口模型，并接種了慢性傷口中最常見的致病菌S. aureus，將各組MNs貼片施用于傷口處。與其他組相比， RE@SA-Con A/SNO微針有效且持續(xù)地消除了傷口處的S. aureus，并加速體內(nèi)傷口愈合過程。此外，在傷口愈合過程中，持續(xù)監(jiān)測小鼠體重變化，結(jié)果顯示無顯著變化，這也表明微針貼片具有良好的生物相容性。

圖7. RE@SA-Con A/SNO MNs在體內(nèi)的應(yīng)用。a）體內(nèi)實驗的時間方案。b）接受不同治療后第 0 、3 、5 、7和9天的小鼠皮膚傷口的代表性照片。黑色虛線圓圈表示原始傷口區(qū)域（直徑：1厘米）。c）9天內(nèi)不同組傷口形態(tài)變化示意圖。d）9天內(nèi)不同處理的小鼠皮膚傷口的傷口面積比值-時間曲線。e）小鼠在接受不同治療后9天內(nèi)的體重變化。每個點代表SD ±平均值（n = 7）。

最后，對小鼠傷口處皮膚進(jìn)行病理學(xué)切片染色，H&E、Masson、IL-6、CD31染色表明，RE@SA-Con A/SNO MNs貼片具有良好的促進(jìn)傷口愈合、減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成的作用，進(jìn)一步證明了RE@SA-Con A/SNO微針在促進(jìn)體內(nèi)傷口愈合方面的優(yōu)異能力。

圖8. 體內(nèi)RE@SA-Con A/SNO MNs應(yīng)用后組織再生、炎癥反應(yīng)和血管生成的研究。第9天接受不同處理后a）H&E染色、c）Masson染色和e）IL-6免疫組化染色的代表性明場顯微鏡圖像。b）第9天不同組的表皮厚度定量分析。d）第9天不同組的膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)（CVF） 定量分析。f）第9天不同組的IL-6陽性細(xì)胞定量分析。g）第9天不同處理后用CD31（紅色）和DAPI（藍(lán)色）染色后傷口組織新生血管形成的免疫熒光圖像。h）第9天不同組的CD31陽性細(xì)胞定量分析。每個點代表SD ±平均值（n = 7）。**P < 0.01，***P < 0.001。

結(jié)論：該研究設(shè)計了一種裝有工程化NO釋放納米載體 （RE@SA-Con A/SNO NPs）的新型多功能微針貼片。納米載體由海藻酸鈉聚合物制成，該聚合物封裝了抗菌劑羅氏菌素（Reuterin），并修飾有Con A和NO分子。Con A使NPs通過特異性識別細(xì)菌表面的多糖來靶向有害細(xì)菌，然后釋放抗菌劑60 h，賦予NPs靶向能力，具有高效的抗菌效果。同時，NPs能夠持續(xù)釋放NO，表現(xiàn)出抗炎活性并促進(jìn)組織再生，從而進(jìn)一步促進(jìn)慢性傷口閉合。在S. aureus感染的慢性傷口小鼠模型中，在MNs的幫助下，NPs直接穿透細(xì)菌生物膜并高效遞送至感染的傷口組織，表現(xiàn)出優(yōu)異的消除有害細(xì)菌和加速慢性傷口愈合的能力。