細(xì)胞生長曲線的測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>：

掌握繪制細(xì)胞生長曲線的原理和方法。

細(xì)胞生長曲線的測定背景與原理：

生長曲線是測定細(xì)胞生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。--般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮后貼壁，隨后渡過長短不同的潛伏期，即進(jìn)入快速生長的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入平臺期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，需連續(xù)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通常計(jì)數(shù)6天。為精確起見，一般每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。

[材料、試劑與儀器]

1、實(shí)驗(yàn)材料:

Hela細(xì)胞系。

2、實(shí)驗(yàn)試劑:

DMEM培養(yǎng)基(青霉素，鏈霉素，10%血清) ，0.25%胰蛋白酶溶液， 臺酚藍(lán)染液。

3、實(shí)驗(yàn)儀器:

超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，微量移液器，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，培養(yǎng)瓶，離心管,移液管，廢液缸，蓋玻片, 24孔板。

[方法與步驟]

1、取生長良好的細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按5x104/mL作傳代培養(yǎng)接種于24孔板中，共接種21孔細(xì)胞。1 m/孔。余下三孔可設(shè)傳代培養(yǎng)的對照。

2、24h后每天記錄細(xì)胞數(shù)目，每次取3孔細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)7d。細(xì)胞用胰酶消化后加入一定量的培養(yǎng)基,混勻制成細(xì)胞懸液。取少量懸液與臺酚藍(lán)1:1混臺。取一干凈的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,蓋上蓋片，從蓋片兩邊滴入細(xì)胞懸液使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡，也不能太多，否則會使蓋片浮起而使細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。

3、低倍鏡下觀察，活細(xì)胞不著色，臺盼藍(lán)著色的細(xì)胞呈深藍(lán)色，是不健康或已死亡的細(xì)胞，不能計(jì)數(shù)。

找出計(jì)數(shù)板上的方格，計(jì)算四角大格內(nèi)總細(xì)胞數(shù)，大格線者只計(jì)左側(cè)和上方，不計(jì)右側(cè)和下方細(xì)胞懸液中細(xì)胞

密度計(jì)算公式為:細(xì)胞數(shù)/mL= (四角大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4) x104x2

4、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/mL)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

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